[发明专利]一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法

说明书

本发明公开了一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法。所述疫苗含有非洲猪瘟病毒强免疫原蛋白P30、膜结构蛋白P54、猪IgG1和IgA1的Fc片段即Fcγ、Fcα以及His纯化标签。本发明包括以下步骤：步骤一、将ASFV病毒免疫原蛋白基因p30、p54与Fcγ、Fcα串联；步骤二、分别构建p30‑Fcγ、p54‑Fcα在酵母内融合表达的转录单位；步骤三、经体外酶连、酵母体内转化及同源重组技术，实现2个转录单位串联，并稳定整合入表面展示型酿酒酵母；步骤四、经过基因组水平和蛋白质水平验证，确认获得2种单独表面展示表达P30‑Fcγ、P54‑Fcα融合蛋白的重组酵母菌株，以及1中同时表面展示表达以上两个融合蛋白的串联复合表达型重组酵母菌株。本发明菌株生产技术成熟，适合大规模生产，使用安全，可以诱导靶动物显著的黏膜及体液免疫反应。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起猪的烈性传染病，急性感染时可引起高达100％的致死率。自1921年在肯尼亚被首次报道以来^[1]，已有数十个国家和地区爆发，我国于2018年8月首次发布非洲猪瘟疫情公告，造成了数十亿元的经济损失，今后也将成为我国猪养殖业的巨大威胁。非洲猪瘟病毒因其基因组大(170-190k bp)，基因型多，对其了解和认知还有很多空白，严重阻碍了有效疫苗的研发。

ASFV关键结构蛋白如P30、P54和P72等，已经确认能够在病毒攻击易感细胞后中和病毒，抑制病毒的依附、复制及内化的过程[2]。因而本发明中筛选了潜在可激发保护性体液免疫及细胞免疫的候选基因p30、p54，有研究证明，针对P72和P54蛋白的抗体能够抑制与病毒附着相关的病毒复制周期的第一步，而抗P30蛋白的抗体抑制与病毒内化相关的第二步^[3]。

免疫球蛋白的Fc段具有活化补体、亲细胞、通过胎盘获取并介导与细菌蛋白结合等生物学活性^[4]。Fc受体属于免疫受体家族成员，广泛表达于各种免疫效应细胞表面。结合特异性抗原的抗体通过其Fc段与细胞表面的Fc受体相互作用，进而激发机体产生各种免疫反应如：吞噬作用、胞吞/胞吐作用、氧化猝发、抗体依赖的细胞毒作用等^[5]。预防感染因子进入人体粘膜表面的疫苗必须诱导粘膜和全身免疫反应，以应对早期感染和病原体扩散。粘膜上皮细胞和固有层内免疫效应细胞之间的密切联系表明，通过粘膜表面输送免疫原是实现粘膜和潜在的系统免疫的理想途径^[6]。Fc受体允许胎儿或新生儿通过胎盘或肠道途径获得母体IgG^[7]。然而，这种受体也能在成人9-12岁时通过粘膜表面转运IgG抗体，并对肠道病原体产生耐药性。Fc受体可以跨黏膜上皮转运IgG，所以利用抗原与IgG Fc片段的融合可能使Fc受体介导抗原跨黏膜屏障转运^[8]，联系起体液免疫与细胞免疫。

酵母表面展示技术(Yeast surface display，YSD)是指外源蛋白通过与细胞壁蛋白融合展示在酵母细胞表面的技术。酿酒酵母表面展示系统作为一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，可以克服真核蛋白在原核细胞表达时活性降低或修饰欠缺的缺点^[9]。酵母展示特别适合于选择抗原结合Fc片段，因为它允许通过缺口修复驱动的同源重组快速组合文库构建，而且能够有效展示与Fcγ受体相互作用的糖基化Fc片段^[10]。

发明内容

本发明的目的是提供一种Fc受体介导表达非洲猪瘟病毒蛋白P30、P54的重组酿酒酵母表面展示疫苗株的制备方法以及疫苗株。

本发明的技术方案包括：

ASFV融合蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11。