[发明专利]一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法

权利要求书

1.一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，其特征在于：

包括下列步骤：

步骤1：rrnL基因序列测定，确定第一种香菇的细胞质类型

将第一种香菇的菌丝加入容纳有裂解液的离心管中，在混匀仪上混匀，得到菌丝裂解液，然后以所述菌丝裂解液为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：菌丝裂解液1μL、rrnL基因上游引物0.5 μL、rrnL基因下游引物0.5 μL、PCR Mix 3.0 12.5 μL、无菌 ddH₂O 10.5 μL；PCR反应流程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55 ℃退火30 s，72℃延伸50s，35个循环；72 ℃终延伸7 min；

所述rrnL基因上游引物为：5’-ATTGTCTCGGTGGTTTGGCA-3’，所述rrnL基因下游引物为：5’-CGCTTTTTAAGTTCCCCGATG T-3’；

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用胶回收试剂盒回收特异性片段，连接至克隆载体中，然后转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取5个克隆子进行测序；

rrnL基因分析及细胞质类型确定：用SeqMan软件合并同一菌丝的rrnL基因，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基；将获得的rrnL基因序列与4个线粒体基因组的rrnL相同位置的基因序列进行同源比对，所用软件为MEGA v7.0，构建的系统发育树为邻接树；若该rrnL基因序列与哪个线粒体的rrnL相同位置的基因序列同源性高，则认为该菌丝与同源性高的线粒体基因组属于同一个基因组类型；

步骤2：ITS2序列测定，确定第二种香菇的细胞核类型

将第二种香菇的菌丝加入含有裂解液的离心管中，在混匀仪上混匀，得到菌丝裂解液，然后以所述菌丝裂解液为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：菌丝裂解液1μL、ITS上游引物0.5 μL、ITS下游引物0.5 μL、PCR Mix 3.0 12.5 μL、无菌 ddH₂O 10.5 μL；PCR反应流程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55 ℃退火30 s，72℃延伸50s，35个循环；72 ℃终延伸7min；

所述ITS上游引物为通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，所述ITS下游引物为通用引物ITS4：5’- TCCTCCGCT TAT TGA TATGC-3’；

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用胶回收试剂盒回收特异性片段，连接至克隆载体中，然后转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取10个克隆子进行测序；

ITS2序列分析及细胞核类型确定：用SeqMan软件合并同一菌株完全相同的ITS序列，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基；用MEGA v 7.0软件提取出每个ITS序列中的ITS2序列，然后再用MEGA v 7.0软件将获得的ITS2序列与细胞核类型的共有序列进行比对，构建邻接树；若获得的ITS2序列与某一类型的共有序列同源性高，则认为该ITS2序列属于该类型；最终将同一菌株的所有ITS2序列都进行类型确定，即可确定该菌株最终的细胞核类型；步骤3：创制香菇栽培菌株核质杂交种

将不同的单核菌丝配对在PDA培养基上进行单单杂交，通过在菌落两端挑取菌丝，在显微镜下观察，如果有锁状联合结构形成，则认为配对的单核菌丝之间是可交配的；

筛选出细胞质和细胞核都为A1型的可交配的两个栽培单核菌丝，以及细胞质类型为mt-A2型或mt-B型的野生单核菌丝；然后分别将细胞质类型为mt-A2型或mt-B型的野生单核菌丝与一个细胞质和细胞核都为A1型的栽培单核菌丝进行正交，获得细胞质为mt-A2型或mt-B型、细胞核分别来源于野生单核菌丝和栽培单核菌丝的双核菌丝；然后将该双核菌丝进行单核化、进行步骤1中的rrnL基因序列测定和步骤2中的ITS2序列测定，筛选到一个细胞核来源于栽培菌株而细胞质为mt-A2或mt-B型的单核菌丝；然后继续将该单核菌丝与相应栽培菌株的另一个单核菌丝进行正交，即可获得一个栽培菌株的核质杂交种，即两个细胞核来源于栽培菌株，而细胞质来源于mt-A2或mt-B型的野生菌株；

在确定第一种香菇的细胞质类型时，NC_018365.1和MF774812.1的线粒体类型为A1型，KY217797.1的线粒体类型为A2型，MF774813.1的线粒体类型为B型；

确定第二种香菇的细胞核类型时， SeqNo.5所示ITS2序列的细胞核类型为A1型。

2.根据权利要求1所述的利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，其特征在于：为了进一步稳定该核质杂交种的遗传物质，再将该核质杂交种进行一次回交。