[发明专利]一种快速检测马铃薯黑胫病的RPA引物、试剂盒、方法及系统

说明书

本发明公开了一种快速检测马铃薯黑胫病(Pectobacterium spp.)的RPA引物、试剂盒及快速检测方法，涉及植物病害检测领域。所述RPA引物具有如SEQ ID NO.1‑2所示的核苷酸序列，本发明利用RPA引物对提取的马铃薯黑胫病菌的DNA仅需进行20min的恒温扩增，即可对马铃薯黑胫病进行检测。本发明提供的马铃薯黑胫病RPA检测引物特异性好、灵敏度高、检测高效快捷、操作简便、不需要特殊仪器，能够对马铃薯黑胫病早期诊断提供技术依据。

技术领域

本发明涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种马铃薯黑胫病(Pectobacterium spp.)的RPA检测引物、试剂盒、快速检测方法及系统。

背景技术

马铃薯是以块茎繁殖为主的无性繁殖作物，生产中常会受到病菌的侵染，带菌种薯会传染到下一代种薯，从而影响马铃薯的正常生长发育，降低马铃薯产量，尤其使其种性退化。马铃薯黑胫病是由果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)和狄基氏菌属(Dickeyaspp.)引起的细菌性病害，是一种土传性和贮藏性病害。马铃薯黑胫病又称黑脚病，是以马铃薯植株茎基部变黑的症状而得名的，该病在我国东北、华北、西北等马铃薯产区都有不同程度地发生。马铃薯黑胫病在马铃薯各个生长时期均可发生，包括地上茎部及地下块茎，平均发病率3％～5％，严重时可达40％～50％，甚至绝产。

马铃薯黑胫病(Pectobacterium spp.)是我国常见的细菌性病害，目前报道的果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)有胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacteriumcarotovorum subsp.Brasiliensis)、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)，在我国马铃薯各个种植区域常见的这几种亚种的报道，还未见狄基氏菌属(Dickeya spp.)引起马铃薯黑胫病的报道。黑胫病病菌侵染马铃薯后，前期马铃薯植株茎基部会出现黑褐色，植株叶片变黄、停止生长、腐烂等症状。黑胫病菌可通过灌溉、雨水传播，也可通过昆虫为害造成的伤口侵染，还可以通过农业操作造成的机械伤口侵染，侵染后植株上产生典型的黑胫病症状。后期病株上的病菌在土壤传染薯快，使薯块带菌。在贮藏期间，病菌通过接触健康数块伤口而传染，并能在发病的块茎里存活。同时病菌在种薯块茎或收获过程中遗留在田间未完全腐烂的病薯上越冬，成为翌年的初侵染来源。目前，生产上还没有特效药防治马铃薯黑胫病，田间一旦发病，很难得到控制，由此，马铃薯黑胫病早期的诊断尤为重要。因此建立高效、快速、实用的病菌检测技术，对马铃薯黑胫病的监测和诊断具有重要的意义。

目前检测细菌性病害的方法有血清学检测和聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction，PCR)方法检测、实时荧光定量PCR方法检测(real-time fluorescencequantitative PCR)、实时荧光定量环介导恒温扩增方法检测(real-time fluorescencequantitative loop mediated isothermal amplification)。传统的血清学检测假阳性率较高，PCR和FQ-PCR检测方法需要昂贵的专业仪器，且扩增时间较长，价格昂贵，不适合野外及基层单位应用。FQ-LAMP是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点，但LAMP在检测过程中产生气溶胶，出现假阳性。