[发明专利]一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用。该ELISA方法为双抗原夹心法。通过该方法，获得了检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA试剂盒，其包括辣根过氧化物酶标记的CD2v抗原和CD2v蛋白包被的酶标板。利用本发明设计的试剂盒不仅能大量筛查非洲猪瘟病毒抗体，还能用于鉴别CD2v缺失株免疫猪群中非洲猪瘟疫苗株与野毒株，检测快速、灵敏，特异性好，非常适合非洲猪瘟疫情的大面积快速检测普查，以及猪场将来进行非洲猪瘟的净化与根除，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起高致死率的高度接触性传染病。临床上以高热、内部器官广泛出血、脾肿大且颜色因出血呈现黑色为主要特征。非洲猪瘟病毒基因型众多，目前已知有24个基因型。迄今为止，该病尚无商品化的疫苗，疫情的防控主要依靠加强饲养场生物安全管理、限制生猪和猪产品跨区域流动、对发病动物采取清群扑杀等处置方式，常造成巨大经济损失。世界动物卫生组织将非洲猪瘟列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

1921年，Montgomery首次报道在肯尼亚发生非洲猪瘟疫情。2007年以来，非洲猪瘟在中东欧多个国家扩散并流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，2018年8月，我国辽宁省沈阳市沈北区首次发现非洲猪瘟疫情，经核酸检测和序列比对分析发现，该毒株与俄罗斯和中东欧国家流行的格鲁吉亚毒株(Georgia 2007)属于同一进化支，属于基因II型毒株。随后，在我国的河南、江苏、内蒙古、黑龙江、浙江、安徽等多个省份(自治区、直辖市)呈现散发流行，对我国养猪业造成了数十亿元的经济损失，目前该病仍在蔓延之中。

由于ASF可给养猪业造成毁灭性打击，故对于ASF疫苗的研究从未间断过。迄今，国际上采用基因工程手段获得了多个ASFV基因缺失疫苗候选株，并通过细胞传代致弱和从自然界分离弱毒株的方法获得了弱毒疫苗候选株，基因缺失株疫苗研究较多的是MGF和CD2v基因缺失株。国外2017年构建了CD2v缺失的BA71株(基因I型)已经充分致弱，免疫猪后存活率均100％(Monteagudo,P.L,et al.BA71DeltaCD2：a New Recombinant Live AttenuatedAfrican Swine Fever Virus with Cross-Protective Capabilities.J Virol,2017.91(21).)。2019年国内构建了CD2v和MGF双基因缺失猪，可使免疫猪获得100％的保护(张艳艳等，非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性，中国兽医学报，2019.39(8),1421-1427)。

专利CN102236017A公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其用途，其以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒。然而，所述试剂盒仅能用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛选，并不能鉴别疫苗株与野毒株。因此，将来随着疫苗的大量使用如何鉴别疫苗株与野毒株成为当务之急。

发明内容

本申请的首要目的在于提供一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒。该试剂盒可用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查以及用于鉴别CD2v缺失株免疫猪群中非洲猪瘟疫苗株与野毒株。

本发明的再一目的在于提供上述双抗原夹心ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体中的应用。

本发明的上述目的，通过以下技术方案予以实现：