[发明专利]缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用

权利要求书

1.缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）在异源蛋白生产中的应用，所述的亮氨酸脱氢酶基因序列为SEQ ID NO.1所示，所述的异源蛋白为碱性蛋白酶、角蛋白酶或中性蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌中亮氨酸脱氢酶基因的敲除方法，包括下述步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出缺失亮氨酸脱氢酶基因的上游同源臂和缺失亮氨酸脱氢酶基因的下游同源臂；

（2）通过重叠延伸PCR将缺失亮氨酸脱氢酶基因的上游同源臂和缺失亮氨酸脱氢酶基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-Δbcd；

（6）将敲除质粒T2(2)-Δbcd转入地衣芽胞杆菌中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（7）将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到缺失亮氨酸脱氢酶基因的上游同源臂或缺失亮氨酸脱氢酶基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选缺失亮氨酸脱氢酶基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与缺失亮氨酸脱氢酶基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中，经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌。

4.根据权利要求1所述的应用，当采用缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在碱性蛋白酶、或角蛋白酶或中性蛋白酶的异源蛋白生产时，所使用的发酵培养基的配方包括：10-20g/L葡萄糖、5-13g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆，7-11g/L酵母粉，8-12g/L氯化钠，2-5g/L K₂HPO₄和4-8g/L(NH₄)₂SO₄；或5-10g/L骨蛋白胨、5-10g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆、7-11g/L酵母粉、8-12g/L氯化钠、2-5g/L K₂HPO₄和4-8g/L(NH₄)₂SO₄。