[发明专利]缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用

说明书

本发明涉及地衣芽胞杆菌基因工程改造和蛋白高效表达领域，公开了缺失bcd基因的地衣芽胞杆菌在蛋白生产中的应用，本发明通过基因工程的方法敲除了地衣芽胞杆菌WX‑02中亮氨酸脱氢酶基因bcd，成功得到了缺失基因bcd的地衣芽胞杆菌WX‑02Δbcd，在此基础上转入碱性蛋白酶AprE游离表达质粒pHY‑AprE、角蛋白酶游离表达载体pHY‑Ker、中性蛋白酶游离表达载体pHY‑NprE。相对于对照菌株，本发明所构建得到的工程菌株在上述蛋白酶酶活提升方面效果显著，酶活均提高了23%以上。

技术领域

本发明涉及地衣芽胞杆菌基因工程改造和蛋白高效表达领域，尤其是缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，所述的异源蛋白的包括碱性蛋白酶、角蛋白酶、中性蛋白酶。

背景技术

芽胞杆菌是异源蛋白高效表达的良好宿主，地衣芽胞杆菌是目前异源蛋白尤其是蛋白酶高效工业化生产的常用宿主菌株。蛋白酶是目前应用最为广泛的酶制剂产品，广泛应用于食品、医药、化学工业、废物处理等领域。异源蛋白表达是提高目的蛋白表达水平的有效策略。近年来，越来越多的策略被开发用于提高目的蛋白的合成水平。然而，地衣芽胞杆菌中存在着众多与外源蛋白表达的合成与分泌息息相关的基因，蛋白产量与哪些基因相关仍然是个未知数，通过对相关基因改造的方式得到高产蛋白工程菌也有待进一步研究。

地衣芽胞杆菌中亮氨酸脱氢酶(Bcd)是一类NAD(H)依赖型氧化还原酶，可催化亮氨酸与其相应的支链α-酮酸之间的可逆的还原胺化反应。然而，该基因的表达水平与异源蛋白表达是否有联系并未研究，不可预知。本发明通过在地衣芽胞杆菌中敲除bcd，达到了异源蛋白产量提高的技术效果，说明敲除bcd是提高异源蛋白生产水平的有效策略。

发明内容

本发明的目的之一在于提供缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，所述的亮氨酸脱氢酶基因序列为SEQ ID NO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

缺失亮氨酸脱氢酶(bcd)基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，包括利用本发明的常规方法，将地衣芽胞杆菌中的亮氨酸脱氢酶基因敲除，然后转入异源蛋白表达载体进行蛋白表达，所述的亮氨酸脱氢酶基因为SEQ ID NO.1所示。

以上所述的应用中，优选的，所述异源蛋白为碱性蛋白酶、角蛋白酶或中性蛋白酶；

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02；

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌中的bcd基因敲除方法，包括下述步骤：

(1)以地衣芽胞杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcd基因的上游同源臂和bcd基因的下游同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将bcd基因的上游同源臂和bcd基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

(3)采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

(4)准备质粒T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-Δbcd；

(6)将敲除质粒T2(2)-Δbcd转入地衣芽胞杆菌中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

(7)将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcd基因的上游同源臂或bcd基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；