[发明专利]用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基

说明书

本发明提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，培养方法，及降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法。该液体培养基包括：基础培养基、补料培养基和米诺地尔。该培养基中添加米诺地尔，有效降低了融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程所形成的氧化杂质，而且不影响融合蛋白及抗体类药物的合成及其质量属性，成本低，操作简单，适合工业化大生产。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体地，本发明涉及CHO细胞液体培养基、CHO细胞培养方法，及用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法。

背景技术

单克隆抗体和其它生物药已被广泛用于肿瘤、炎症、代谢疾病等的治疗，并取得了很好的疗效。基于生物药结构的复杂性，其通常需要在生物宿主内合成。用于重组mAb或融合蛋白类药物表达的宿主细胞系有CHO、NS0、Sp2/0、HEK293和PER.C6等。因CHO细胞在蛋白合成过程中具有与人类蛋白相似的翻译后修饰，且易适应无血清培养基，可在限定培养基中悬浮生长，促进了生物工艺的改进放大，并且已证明其可作为可靠的安全宿主，因此重组蛋白药物生产过程中最常用CHO作为宿主细胞。

CHO细胞在蛋白合成过程中，蛋白产物的合成情况除与克隆本身有关外，与其培养条件密切相关。蛋白合成过程中的翻译后修饰对其生物活性及稳定性等至关重要。蛋白合成过程中，常见的翻译后修饰有氧化，磷酸化、脱氨、C-端的切除、糖基化等。氨基酸的氧化会改变生物大分子的二级、三级结构，从而可能导致其生物活性的改变，半衰期的缩短，形成聚集体等。蛋白合成过程中由于相关酶的催化作用或细胞代谢所产生的活性氧的作用而将氨基酸残基氧化形成氧化杂质。

Hazeltine L B等人研究发现通过调整培养基中锰离子，铜离子，半胱氨酸及色氨酸浓度可降低色氨酸氧化(Biotechnol Prog,2016)，同时Yun Z等人研究发现添加谷胱甘肽和铁离子螯合剂可降低胞内的活性氧水平(J Biosci Bioeng,2003)。还有文献报道添加硫辛酸、甲硫氨酸、N-乙酰半胱氨酸及半胱氨酸可调整细胞内的活性氧水平，从而减少蛋白的氧化(Exp Toxicol Pathol,2008)。Hou Y等人在2019年的Biotechnol J杂志上发表了其最新研究：通过增加培养基中烟酰胺、半胱氨酸的浓度，可缓解蛋白合成过程中的赖氨酸的羟基化。这些方法或多或少会对产物的表达或其质量属性产生影响，如培养基中加金属离子会降低氧化，但同时也会改变培养基的pH和渗透压进而影响细胞的生长。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

现有技术中融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程容易形成氧化杂质。基于上述问题的发现，发明人提出一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，发现CHO细胞培养过程中在培养基中添加米诺地尔可在不影响细胞生长及产物合成、不影响目的产物的其它质量属性的情况下降低氧化杂质，且在培养基及细胞克隆变化时依然对融合蛋白及抗体类药物的氧化杂质具有降低效果。本发明适于解决融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程所形成的氧化杂质问题。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基。该培养基包括培养基添加物，所述培养添加物为米诺地尔，所述液体培养基能够降低蛋白合成中氧化杂质的形成。

在一些实施例中，所述液体培养基还包括基础培养基和补料培养基。

在一些实施例中，将米诺地尔配成母液，在细胞接种0-10天内一次性添加或在培养过程中分阶段多次添加。

在一些实施例中，本发明所述米诺地尔的使用浓度为0.1-1mM。

在一些实施例中，本发明所述米诺地尔的使用浓度为0.6mM。

在一些实施例中，本发明所述米诺地尔的使用浓度为0.3mM。