[发明专利]定量检测样品中乙型肝炎病毒RNA的方法及其系统在审
| 申请号： | 201911298946.X | 申请日： | 2019-12-17 |
| 公开（公告）号： | CN110904275A | 公开（公告）日： | 2020-03-24 |
| 发明（设计）人： | 刘利成;冯华华;胡小许;王玲娟;李春明;王鹏志 | 申请（专利权）人： | 江苏宏微特斯医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 226400 江苏省南通市如东县掘*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 定量 检测 样品 乙型肝炎 病毒 rna 方法 及其 系统 | ||
1.一种定量检测样品中乙型肝炎病毒RNA的方法，其特征在于，所述方法通过直接定量样品中乙型肝炎病毒DNA的量来定量所述样品中乙型肝炎病毒RNA的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR方法和乙型肝炎病毒DNA定量标准品的定量标准曲线来定量所述乙型肝炎病毒DNA的量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：提取所述样品中乙型肝炎病毒的核酸DNA和RNA；
步骤2：针对乙型肝炎病毒DNA和RNA序列的共同保守区域设计特异性上、下游引物和探针；
步骤3：用所述引物和探针分别配制含逆转录酶的荧光PCR试剂和不含逆转录酶的荧光PCR试剂，用PCR方法检测所述样品中乙型肝炎病毒的核酸DNA和RNA，其中用不含逆转录酶的荧光PCR试剂检测乙型肝炎病毒DNA时设置标准曲线对样品中乙型肝炎病毒DNA进行标定；和
步骤4：根据以下公式计算样品中的乙型肝炎病毒RNA量：
其中Ct RNA+DNA为含逆转录酶的荧光PCR试剂扩增Ct值，Ct DNA为不含逆转录酶的荧光PCR试剂扩增Ct值，QDNA为样品中标定的乙型肝炎病毒DNA浓度，QRNA为样品中的乙型肝炎病毒RNA的浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的PCR方法是RT-PCR方法，即在PCR扩增之前，包含一步逆转录酶扩增过程。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1中乙型肝炎病毒的DNA和RNA的提取是DNA和RNA同时提取。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述上、下游引物的Tm值55℃～65℃，GC含量40％-60％；和所述探针的Tm值65℃～75℃，GC含量40％-70％。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的上游引物为SEQ ID NO:1：GAGGCTGTAGGCATAAATTGG；下游引物为SEQ ID NO:2：ACAGCTTGGAGGCTTGAACAGT；和所述探针序列为SEQ ID NO:3：TGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTC。
8.在权利要求1-7中任一项所述方法中使用的系统，其特征在于，所述系统包括：a.提取乙型肝炎病毒的DNA和RNA的提取试剂盒；b.用于扩增乙型肝炎病毒的RNA的含逆转录酶的荧光PCR扩增体系和用于扩增乙型肝炎病毒的DNA的不含逆转录酶的荧光PCR扩增体系；和c.用于乙型肝炎病毒的DNA定量的标准品。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述含逆转录酶的荧光PCR扩增体系和所述不含逆转录酶的荧光PCR扩增体系分别都含有上游引物序列SEQ ID NO1：GAGGCTGTAGGCATAAATTGG；下游引物序列SEQ ID NO 2：ACAGCTTGGAGGCTTGAACAGT；和探针序列SEQ ID NO 3：CTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTC。
10.根据权利要求8-9任一项所述的系统在乙肝指导用药中的应用。
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