[发明专利]定量检测样品中乙型肝炎病毒RNA的方法及其系统

说明书

本发明提供一种定量检测样品中乙型肝炎病毒RNA的方法及其系统，所述方法通过直接定量样品中乙型肝炎病毒DNA的量来定量所述样品中乙型肝炎病毒RNA的量。本发明方法及其系统对其他病原体或人基因组无非特异扩增，特异性好；在没有HBV RNA标准物质的情况下，通过直接定量HBV DNA的量来定量HBV RNA的量，简单、方便。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种定量检测样品中乙型肝炎病毒RNA的方法及其系统。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)。HBV DNA长链为负链，位置和长度相对固定。短链为正链，其长度可变，约为负链的50％～80％。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，世界卫生组织报告全球约有20亿人感染过HBV，其中3-4亿人为慢性HBV感染。在我国肝硬化和肝癌患者中，由HBV感染引起的比例分别高达60％和80％以上。现有的治疗药物主要为核苷酸类似物，虽然能够有效抑制病毒，但是存在长期用药、病毒耐药、病毒载量反弹等问题。

根据HBV的复制感染机制，慢乙肝难以治愈和引起停药后病毒学反弹的主要原因是存在于感染肝细胞核内的病毒复制模板-HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)难以清除。目前的停药指标主要有三种。一是血清HBV DNA低于检测下限作为停药的治疗终点，但研究发现该指标并不能客观反映cccDNA的转录活跃状态，有很大的病毒学反弹和疾病复发风险；二是临床上以血清HBV表面抗原(HBsAg)转阴作为临床治愈的指标，结果也不尽如人意，因为除了完整的Dane颗粒，HBsAg还有另外两种存在形式，数量远超Dane颗粒，且随着HBV病毒核酸长期存在于肝细胞内，HBV核酸片段能够整合到宿主基因组中，也能转录翻译产生HBsAg，会使多数慢乙肝患者面临着终生用药。三是cccDNA的清除，这是最理想的停药指标，但由于cccDNA存在于感染的肝细胞内，只能通过肝组织活检来判断病毒的清除和安全停药，这在临床实践中并不适用。

临床在治疗慢性乙肝过程中，常采用监测患者血清/血浆中HBV DNA的量来反应抗病毒治疗的疗效，但因为目前常用抗病毒药物“核苷(酸)类药物”主要作用于HBV DNA的合成阻断，血液中的HBV DNA水平经过一段时间抗病毒治疗后迅速下降并消失。但由于cccDNA的持续存在，且其转录活性不受影响，血液中仍存在HBV RNA。前期研究者也揭示血清HBVpgRNA的水平可反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录活性状态。所以，血液中HBV DNA和RNA均为HBV cccDNA存在和复制的标志，血液中HBV总核酸(HBVDNA+RNA)的定量检测显得尤为重要。

但目前市场上仅有针对HBV DNA定量检测的试剂，暂无HBV RNA的定量检测试剂，且国际或国内均无HBV RNA定量的相关标准物质，给HBV RNA准确定量带来困扰。本发明通过定量HBV DNA的量来计算患者血液中HBV RNA的量，简单、方便。

发明内容

在一种实施方式中，本发明提供一种定量检测样品中乙型肝炎病毒RNA的方法，所述方法通过直接定量样品中乙型肝炎病毒DNA的量来定量所述样品中乙型肝炎病毒RNA的量。

在一种实施方式中，通过PCR方法和乙型肝炎病毒DNA定量标准品的定量标准曲线来定量所述乙型肝炎病毒DNA的量。

在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：步骤1：提取所述样品中乙型肝炎病毒的核酸DNA和RNA；

步骤2：针对乙型肝炎病毒DNA和RNA序列的共同保守区域设计特异性上、下游引物和探针；