[发明专利]一种检测待测样品中各个微生物物种的基因组DNA拷贝数的方法

说明书

本发明公开了可以高通量检测待测样品中总细菌基因组DNA含量m_bac、各个微生物物种的基因组DNA含量m_i、各个微生物物种的基因组DNA拷贝数N_i和各个微生物物种细胞数U_i的犯法。采用本发明提供的方法和qPCR方法检测测试品，测得的各个物种基因组质量浓度，在不同微生物组成、不同微生物核酸比例下均具有极高的线性相关性，说明本发明提供的方法具有较高的准确性。本发明使得临床病原微生物宏基因组NGS检测方法得出的结果在不同样品之间具备可比性，将传统的临床病原微生物宏基因组NGS检测由定性检测方法提升为定量检测方法，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种检测待测样品中各个微生物物种的基因组DNA拷贝数的方法。

背景技术

目前，宏基因组鸟枪法二代测序微生物检测技术应用于临床样品的病原物检测，主要是用物理方法、化学方法或生物方法对临床样品中的核酸进行随机打断，构建二代测序文库，使用二代测序仪进行高通量测序，然后使用生物信息学方法分析测序短读段的物种来源，以测序短读段数量作为检出指标的微生物检测方法。该方法可以定性检出微生物，但无法检测微生物的数量，且检测指标在不同样品之间不具有可比性。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，通过标准曲线对未知样品进行定量分析的方法。具体如下：(1)梯度稀释已知浓度的标准样品，然后使用实时荧光定量PCR方法检测各稀释度样品的Ct值；(2)以标准品浓度或拷贝数为横坐标，相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；(3)使用实时荧光定量PCR方法检测未知样品的Ct值，然后根据标准曲线，获得未知样品的浓度或拷贝数。但是一个实时荧光定量PCR反应体系只能检测一个未知样品，检测多个未知样品费时费力，即无法实现高通量检测。

发明内容

本发明的目的为定量检测待测样品中总细菌基因组DNA含量m_bac、各个微生物物种的基因组DNA含量m_i、各个微生物物种的基因组DNA拷贝数N_i和各个微生物物种细胞数U_i。

本发明首先保护一种检测待测样品中总细菌基因组DNA含量m_bac的方法，可包括步骤(a)和步骤(b)：

所述步骤(a)包括如下步骤：

(a-1)根据待测样品的来源获得通常含有的细菌种类，每个细菌种类选择一个具有代表性的细菌菌株作为标准菌株，由各个标准菌株组成标准菌株群；

(a-2)比对标准菌株群中各个标准菌株16s rDNA的序列，获得特异DNA片段；所述特异DNA片段位于各个标准菌株16s rDNA的保守区且与各个标准菌株16s rDNA的匹配区域的同源性在90％以上(如90％-95％、95％-100％、90％、95％或100％)；

(a-3)混合标准菌株群中各个标准菌株的总DNA，得到标准菌株群总DNA；之后稀释，得到不同浓度的标准菌株群总DNA标准品；

(a-4)将不同浓度的标准菌株群总DNA标准品进行荧光定量PCR，采集相应的Ct值；进行荧光定量PCR的引物的靶标为所述特异DNA片段或所述特异DNA片段的一部分；

(a-5)以标准菌株群总DNA标准品的浓度作为横坐标，相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

所述步骤(b)包括如下步骤：

(b-1)将待测样品的总DNA进行荧光定量PCR，采集Ct值；进行荧光定量PCR的引物的靶标为所述特异DNA片段或所述特异DNA片段的一部分；

(b-2)将步骤(b-1)采集的Ct值代入所述标准曲线，得到待测样品中总细菌基因组DNA的浓度；