[发明专利]基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法

权利要求书

1.基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：所述方法包括如下所述的步骤：

一、构建PCPA失眠大鼠模型；

二、大鼠腹腔注射PCPA二日，模型复制成功后，于第三日开始每天早8:00灌胃给药，每日一次；蒙药组以高中低剂量组给予灌胃；阳性对照组以相同体积灌胃给予安神补脑口服液；空白对照组和模型对照组灌胃给予同体积的蒸馏水；连续灌胃给药7天，于末次给药60min后对大鼠进行脱颈椎处理；采用氯甲酸酯衍生法对大鼠脑组织代谢物进行衍生，优化测定条件；

三、采用GC-MS分析，NIST数据库检索进行峰识别，面积归一化处理；

四、使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据分析；

五、采用Metaboanlayst3.0和KEGG数据库模拟剖析代谢通路，确定失眠的潜在生物标志物和相关代谢通路；

六、采用LC-MS/MS多反应监测模式测定给药后大鼠脑皮层、脑干、下丘脑、海马组织中5-羟基色胺、5-羟基吲哚乙酸、多巴胺、去甲肾上腺素、牛磺酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸神经递质和相关前体及代谢物含量，明确苏格木勒-4对脑内神经递质合成代谢的作用位点，阐明苏格木勒-4抗失眠作用机理。

2.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：在所述的步骤一中，所述PCPA失眠大鼠模型的构建方法是将大鼠按体重随机分为正常对照组、模型对照组、蒙药组和安神补脑口服液组，每组10只；除正常对照组外，其余3组大鼠于每日上午8:00腹腔注射PCPA混悬液lml/100g，每日1次,连续注射2日，正常对照组腹腔注射同体积的弱碱性生理盐水；于第一次腹腔注射24-28h后，动物出现昼夜节律消失，白天也活动不停，表明模型复制成功。

3.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：在所述的步骤二中，所述的衍生包括如下所述的步骤：

一、将大鼠断头取脑，在冰盘上分离皮层、海马、脑干和下丘脑，将各组织沿中轴线切割，各组织左右两侧于-80℃冰箱中分别保存；

二、从-80℃冰箱中取出组织，置于匀浆仪中，加入4倍水，匀浆30s至无组织碎块，取200μL匀浆液置EP管中，加入125μL氯仿，375μL甲醇，冰浴超声10min，取上清液300μL于进样小瓶中，氮气吹干；

三、残渣加入15mg·mL-1的30μL盐酸甲氧胺吡啶溶液，70℃反应1h，再加入含1％TMCS的50μL MSTFA，40℃反应90min；

四、最后加入内含0.1mg·mL-1二十四烷的500μL正庚烷，涡旋1min，然后进行GC-MS分析。

4.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：在所述的步骤二中，所述的测定条件包括色谱和质谱检测条件，所述的色谱检测条件包括色谱柱:DB-5MS毛细管柱，进样量1μL，进样口温度260℃，离子源温度200℃，程序升温起始温度60℃，保持2min，以7℃·min-1升至140℃，以5℃·min-1升至180℃，保持66min，再以5℃·min-1升至280℃，保持2min，载气：氦气，载气流速：1mL·min－1；质谱检测条件：电离方式EI，电子能量70eV，质谱扫描范围：全扫描模式，m/z50～650。

5.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：在步骤三中，所述的GC-MS分析方法包括如下所述的步骤：

一、GC-MS数据通过GC-MS仪器工作站软件Xcalibur将RAW格式转化为netCDF格式；

二、导入XCMS软件中进行预处理，将软件所生成txt文件导入Excel软件中进行面归一化处理；

三、采用代谢组学软件SIMCA P11.0软件包进行主成分分析(PCA)和最小二乘法判别分析(PLS-DA)，score图分开的前提下，通过载荷图中的VIP值来寻找生物标志物；

四、通过标准质谱数据库(NIST05)检索匹配结合标准品对照对部分代谢物进行指认。