[发明专利]一种改良CIK细胞培养基及其使用方法

权利要求书

1.一种改良CIK细胞培养基，其特征在于，包括下列原料制成：

适量核苷酸与脱氧核苷酸。

2.如权利要求1所述的一种改良CIK细胞培养基，其特征在于，包括下列原料制成：

适量核苷酸与脱氧核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的一种改良CIK细胞培养基，其特征在于，还包括下列原料：

IFN-γ 500～1000U/ml；

鼠抗人CD3单抗 50～100ng/ml；

IL-2 500～1000U/ml。

4.如权利要求3所述的一种改良CIK细胞培养基，其特征在于，还包括下列原料：

IFN-γ 1000U/ml；

鼠抗人CD3单抗 50ng/ml；

IL-2 1000U/ml。

5.一种如权利要求1或2所述的改良CIK细胞培养基的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞密度至1×10⁹个/L，悬于含100～200ml/L的FBS；1～2mmol/L的谷氨酰胺；100μg/L的青霉素、100μg/L的链霉素；20～100mmol/L的HEPES；8～15mmol/L的丙酮酸钠；20～50μmol/L的β-巯基乙醇；适量核苷酸与脱氧核苷酸的CIK细胞培养基中；

步骤(2)，在上述CIK细胞培养基中加入500～1000U/ml的IFN-γ，37℃，5％CO2条件下培养24h后，加入50～100ng/ml的鼠抗人CD3单抗与500～1000U/ml的IL-2，37℃，5％CO₂条件下培养3、6、9、12、15、18d，进行细胞增殖水平、细胞表型及体外细胞毒活性检测；

步骤(3)，于培养当天及3、6、9、12、15、18d，采用台盼蓝拒染法计数细胞，检测细胞的增殖水平；

步骤(4)，于培养当天及3、6、9、12、15、18d，采用流式细胞术分析细胞的CD3+CD56+百分率，测定细胞表型；

步骤(5)，CIK细胞培养15天，检测其对肺腺癌细胞株SPC-A-1和胃腺癌细胞株BGC-823细胞的细胞毒活性；调整肿瘤细胞浓度为1×10⁵个/ml，分别按1∶4；1∶8；1∶16的比例与CIK细胞混合，各浓度均设3复孔，同时设肿瘤细胞对照和空白对照；培养48h后，弃上清，用培养液洗涤3次，加入5mg/ml的MTT，50μl/孔，37℃，5％CO₂培养箱培养4h，每孔加入100μl的DMSO，温育至结晶溶解，在酶标仪570nm波长处测定吸光度A值，计算得出杀瘤率，得到该改良CIK细胞培养基培养的CIK细胞，细胞数量明显增多，杀瘤效应明显增强。

6.如权利要求5所述的一种改良CIK细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中杀瘤率计算公式如下：

7.如权利要求5所述的一种改良CIK细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)，培养至第13～14天，收获细胞。