[发明专利]一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法

权利要求书

1. 一种重组Prestin的AAV-2病毒载体与原位凝胶在制备无创的内耳耳蜗外毛细胞基因转染给药系统中的应用，其特征在于，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin 的AAV-2腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，经鼓膜穿刺鼓室给药的圆窗途径对红目豚鼠耳蜗进行基因转染；所述原位凝胶的制备是按照：取泊洛沙姆 407与蒸馏水按 1:5配于烧杯中，于4°C冰箱加入制备好的病毒液，按原位凝胶：病毒液=1:9配比，构成内耳基因转染载体系统，原位凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，是一种特殊的内耳药物载体，利用原位凝胶将化学药物经鼓膜穿刺注射入中耳，在内耳圆窗膜上形成储层效应，可有效控制药物释放进入内耳的速度，达到缓释效果；转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和 Prestin蛋白的表达及分布、Western-Blot检测耳蜗基底膜 Prestin表达水平，最后通过统计学分析结果。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼓膜穿刺鼓室给药的具体方法如下：取戊巴比妥钠对红目豚鼠进行麻醉，麻醉完成后使用微量注射器于4℃下取药0.1ml经鼓膜穿刺注射入红目豚鼠鼓室中，左耳注射的混合液为原位凝胶：重组病毒液=1:9，右耳作为对照注射的混合液为原位凝胶：PBS液=1:9。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鼓膜穿刺鼓室给药过程中需保持全程无菌操作。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个红目豚鼠麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，浸泡于4%多聚甲醛过夜，用6%稀硝酸脱钙4小时，梯度乙醇脱水，将耳蜗组织制成石蜡切片；

选择CY3标记的绿色荧光蛋白抗体，DAPI染料标记细胞核显示耳蜗组织结构轮廓；用0.2%的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，干燥后加CY3标记的绿色荧光蛋白抗体室温孵育两小时，PBS液漂洗3次，用DAPI标记的羊抗兔IgG，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，干燥后铺片，封片；置于激光共聚焦显微镜下观察，按照10×10倍进行拍照，观察绿色荧光蛋白在耳蜗组织内的表达及分布。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个红目豚鼠麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2%的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，加入CY3标记的绿色荧光蛋白抗体，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，用羊抗兔IgG与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察，按照10×100倍进行拍照，观察绿色荧光蛋白在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测Prestin的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个红目豚鼠麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2%的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，加入CY3标记的Prestin抗体，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，用羊抗兔IgG与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察，按照10×100倍进行拍照，观察Prestin在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个红目豚鼠麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗剥离基底膜，将各基底膜低温碾磨后加入RIPA裂解液冰上裂解20min，10000rpm、4℃、10min离心后收集上清蛋白液备用；用Wes仪进行Western-blot检测，样品处理严格按照试剂盒Wes 12-230kDa Mouse Master kit和Wes12-230kDa Master kit with split Buffer的操作步骤，反应参数为：分离胶吸取200s、浓缩胶吸取15s、吸样9s、采用恒压375V进行电泳25min、凝胶清除230s、洗涤3次，每次150s、封闭5min、Prestin抗体孵育30min、CY3标记羊抗兔IgG孵育30min、发光液曝光50s；实验结果显示各样品灰度值，以GAPDH为内参计算Prestin的相对灰度值表示其表达水平。