[发明专利]一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法

说明书

本发明公开了一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin蛋白的表达及分布、Western‑Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平。本发明实现了内耳耳蜗无创给药基因转染的突破，避免了传统外科手术暴露鼓室对听觉器官的损伤，对内耳的基因转染具有一定的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物医药的研究和应用，具体是一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法。

背景技术

内耳基因转染是各种感音性听力损失机制研究和生物治疗的重要技术，但是由于内耳结构相对封闭，与全身血液循环之间存在血-迷路屏障，系统给药途径进入内耳的药物剂量极为有限，而既往内耳基因转染是通过外科手术暴露鼓室的方式，对外耳道和中耳可造成永久性损害，具有副作用大和操作困难等缺陷。

目前，内耳药物载体主要包括病毒载体、纳米粒载体、蛋白质载体和原位凝胶，多种给药载体为内耳药物递送的研究带来了进步，而内耳基因载体主要是病毒载体和质粒，但迄今为止内耳基因转染仍然缺乏有效的，非侵入性递送系统，故建立一个新型的无创内耳基因转染给药系统具有极大的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺(非外科方法)鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；

转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin蛋白的表达及分布、Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平，最后通过统计学分析结果。

作为本发明再进一步的方案，所述鼓膜穿刺鼓室给药的具体方法如下：取戊巴比妥钠对实验对象进行麻醉，麻醉完成后使用微量注射器于4℃下取药0.1ml经鼓膜穿刺注射入实验对象鼓室中，左耳注射的混合液为原位凝胶：重组病毒液＝1:9，右耳作为对照注射的混合液为原位凝胶：PBS液＝1:9。

作为本发明再进一步的方案，所述鼓膜穿刺鼓室给药过程中需保持全程无菌操作。

作为本发明再进一步的方案，所述免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，浸泡于4％多聚甲醛过夜，用6％稀硝酸脱钙4小时，梯度乙醇脱水，将耳蜗组织制成石蜡切片；

选择CY3标记的绿色荧光蛋白抗体，DAPI染料标记细胞核显示耳蜗组织结构轮廓；用0.2％的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，干燥后加CY3标记的绿色荧光蛋白抗体室温孵育两小时，PBS液漂洗3次，用DAPI标记的羊抗兔IgG，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，干燥后铺片，封片；置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×10倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗组织内的表达及分布。