[发明专利]一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量RT-PCR方法

权利要求书

1.引物组在制备用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的试剂中的应用，所述引物组为用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因片段的特异性引物对，所述HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的特异性引物对的序列依次如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16所示。

2.引物组在非诊断目的的H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异检测中的应用，所述引物组为用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因片段的特异性引物对，所述HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的特异性引物对的序列依次如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16所示。

3.一种非诊断目的的检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的方法，其特征在于，采用引物组进行实时荧光定量RT-PCR检测，所述引物组为用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因片段的特异性引物对，所述HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的特异性引物对的序列依次如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）待测样品RNA提取；

（2）RNA反转录合成cDNA；

（3）以cDNA为模板、采用所述引物组进行荧光定量PCR扩增，获得HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的扩增曲线；

（4）分析荧光定量PCR的扩增曲线，若HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段均出现特异性扩增曲线，则判断待测样品为H7N9亚型禽流感病毒或待测样品中含有H7N9亚型禽流感病毒；

（5）根据标准曲线计算待测样品中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的拷贝数，根据各基因片段的拷贝数比例判断基因组包装变异。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃10min；95℃ 15s，59℃ 1min，40个循环；

所述荧光定量PCR扩增的20μL反应体系为：每管反应体系为，反应体系如下：2×SYBRPremix ExTaq 10μL，上游引物 0.5μL，下游引物0.5μL，cDNA 2μL，加水补足至20μL。