[发明专利]一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量RT-PCR方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量RT‑PCR方法。本发明提供分别针对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的高度保守区的特异性引物对，利用这些特异性引物对进行实时荧光定量RT‑PCR检测H7N9亚型流感病毒基因组中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的拷贝数，进而检测H7N9亚型流感病毒的基因组包装变异。该方法具有特异性高、灵敏度高、准确性高、检测时间较短，成本低等优势，能够对病毒滴度较低的临床样品做出准确诊断，适用于H7N9亚型禽流感病毒的临床诊断和流行病控制。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组、试剂盒以及利用该引物组进行实时荧光绝对定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的方法。

背景技术

H7N9亚型禽流感病毒为新型重配病毒，已有研究表明该病毒的HA基因来源于鸭群中流行的H7亚型流感病毒，NA基因来源于鸭群或者野鸟中的N9亚型流感病毒，内部基因来源于中国鸡群中流行的H9N2病毒。为了检测H7N9亚型流感病毒并研究其基因组的变异和进化情况，需要对病毒的基因片段进行定性及定量。

禽流感病毒的常规检测方法主要为鸡胚病毒分离试验和HA、HI试验。采用鸡胚进行病毒的分离培养(一般需要2～3天)，然后采用血凝抑制试验进行流感病毒亚型及分支的鉴定(一般需要1天)。HA、HI试验特异性好，但其操作过程繁琐费时。而利用常规方法，即收集有血凝性的鸡胚尿囊液提取RNA，运用流感病毒HA、NA基因的通用引物进行全长扩增并克隆测序，进行流感病毒亚型鉴定(一般需要2天)，这种检测方法费时、费力而且特异性差，不能做出快速及时而准确的诊断。因此，临床上，迫切需要一种能快速准确鉴定并定量H7N9亚型流感病毒的基因组片段、分析的方法。

实时荧光定量PCR技术是近年发展成熟的基因体外复制扩增技术，它可以使微量的DNA在数小时内以指数式增长，该方法具有灵敏度高、特异性强、简便快捷等优点。实时荧光定量PCR检测系统包含探针类方法和非探针方法，其中，非探针方法为利用荧光染料(如SYBR Green I染料)以及特异性引物来指示模板的扩增情况。由于荧光染料能够结合DNA双链，发射荧光信号，但是不能区分目的DNA和引物二聚体以及非特异性片段。因此，非探针方法的特异性完全由引物决定，因此非探针方法对于引物的要求很高，需要尽量避免引物二聚体和非特异性扩增的形成，确保引物的特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效快速检测H7N9亚型禽流感病毒以及其基因组包装变异的引物组以及利用该引物组进行实时荧光绝对定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明根据H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的保守区分别设计特异性引物，序列设计特异性引物对，通过大量优化和筛选得到能够满足非探针法荧光绝对定量RT-PCR检测要求的上述各基因片段的特异性引物对。利用这些特异性引物对进行荧光定量RT-PCR检测，不仅能够用于H7N9亚型禽流感病毒的鉴定，同时能够通过对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因拷贝数的定量实现特异灵敏的H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的检测。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组，包括用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1-16所示。

具体地，所述用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组包括如下引物：

HA基因的引物：