[发明专利]一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法有效
| 申请号： | 201911304475.9 | 申请日： | 2019-12-17 |
| 公开（公告）号： | CN112094862B | 公开（公告）日： | 2022-04-19 |
| 发明（设计）人： | 闵玲;张军;徐孝兰;李宁;张献龙;郭小平 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/60;A01H1/02 |
| 代理公司： | 深圳泛航知识产权代理事务所(普通合伙) 44867 | 代理人： | 邓爱军 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 带有 标记 棉花 雄性不育 创制 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种同时被敲除三个基因且花药表面带有黑斑标记的棉花雄性不育系的创制方法，其特征包括下列步骤：
(1)在陆地棉中筛选得到可以作为标记的GhEMS1基因的三个DNA片段，所述的DNA片段分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，以上述三个DNA片段的保守区域设计共有的靶位点sgRNA1和sgRNA2；
其中sgRNA1的核苷酸序列如下所示：
sgRNA1：AACCTGACCGCTCTTTACAT；
sgRNA2的核苷酸序列分别如下所示：
sgRNA2：CAGTGAAATTGTTGGAGTCA；
(2)利用PCR方法将sgRNA1-guidRNA与sgRNA2-guidRNA进行串连，通过一步克隆法构建到CRISPR/Cas9载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ上，最终得到高效转化载体GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2；
(3)利用农杆菌介导的方法转化宿主棉花，获得花药表面带有黑斑标记的棉花雄性不育系。
2.权利要求1中所述的sgRNA1和sgRNA2在培育棉花雄性不育系中的应用。
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