[发明专利]一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法。本发明提供利用CRISPR‑Cas9系统创造带有新型标记的棉花雄性不育系。本发明的特征在于，选取特异针对GhEMS1基因的靶位点sgRNA1、sgRNA2，与Cas9蛋白在棉花内稳定表达，获得带有新型标记的棉花雄性不育系。转基因再生植株的花药表面带有黑斑表型可稳定地遗传至下一代，且不育性稳定。本发明的优点在于克服了传统人工去雄方法做杂交费时费力的缺陷，并且不育株带有黑斑标记，便于早期确定不育株。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法及其应用。本发明提供利用CRISPR-Cas9系统创造带有新型标记的棉花雄性不育系创制方法。选取特异针对GhEMS1基因的靶位点sgRNA1、sgRNA2，与Cas9蛋白在棉花内稳定表达，获得带有新型标记的棉花雄性不育系。转基因再生植株的花药表面带有黑斑表型可稳定遗传至下一代，且棉花雄性不育性稳定。本发明的优点在于克服了传统人工去雄方法做杂交费时费力的缺陷，并且不育株带有黑斑标记，便于早期确定不育株。

背景技术

杂种优势可以大幅度提高农作物产量，棉花作为重要的经济作物，也具有明显的杂交优势，陆地棉品种间杂交种的强优势组合可增产20％～30％。在20世纪90年代取得突破，培育出一大批抗虫优质杂交棉品种，在生产上大面积推广应用。例如，中国农业科学院棉花研究所的培育的“中棉所”系列，华中农业大学培育的的“华杂棉”系列，山东省棉花研究中心培育的“鲁棉研”系列，湖南省棉花研究所培育的“湘杂棉”系列等等。在棉花雄性不育利用方面，四川省农业科学院于1972年发现“洞A型”细胞核雄性不育系后，随即开展棉花细胞核雄性不育系及杂交种选育，培育出“川杂”系列核不育杂交种。国内多个单位利用引进“洞A型”核不育两用系或转育出新的核不育系，也培育一系列杂交种。中国农业科学院棉花研究所引进ms5ms5ms6ms6双隐性核不育系，通过杂交和回交改良，培育出“中棉所38”等多个杂交棉品种。河北省邯郸市农业科学院从海陆杂种后代中筛选出104-7A胞质不育系，育成了“邯杂98-1”等多个国家审定或省审定的三系杂交棉品种。现有的人工去雄授粉制种方法费工费时，近年来随着农村劳动力短缺，杂交棉种子成本逐年高涨，杂交棉应用面积大幅度减少，因此创造出育性稳定可靠的雄性不育系是我国杂交棉生产必须解决的技术问题。

CRISPR/Cas9系统直接作用于DNA，可对几乎任意基因组区域进行编辑，影响相应基因的功能，方法简单、精确、高效，成为近年植物基因组学研究的热点。在棉花上，Wang等(Wang et al.2018)针对1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Cloroplasto alterados，CLA)的A、D亚基因组设计了两个sgRNA，以指导Cas9介导的异源四倍体棉花基因组编辑。测序结果表明，两个靶位点分别发生了80％以上的突变频率，所有样品均未检测到脱靶的情况，说明CRISPR/Cas9系统可以高效率和高特异性在异源四倍体棉花基因组上产生DNA水平突变。

基因编辑在植物不育系的创制上得到有效应用，水稻TMS5是中国应用广泛的温敏核雄性不育系的主效基因，Zhou等在TMS5的编码区设计了10个靶位点，使用CRISPR/Cas9系统进行定向诱变，创造了新的不含转基因元件的温敏不育系。建立的TMS5ab二元构建体，可用于籼、粳两个亚种的温敏不育系快速培育(Zhou et al.2016)。Ms45是玉米中发现的一个雄性不育基因，该基因编码一种花粉发育必需的类胡萝卜素合成酶。Singh等(Singh etal.2018)为了研究Ms45基因在小麦中的作用，使用CRISPR/Cas9技术，对小麦3个同源染色A、B和D的Ms45同源基因进行了编辑，获得突变体。三个同源位点的同时突变，造成小麦的雄性不育，该不育系可被非同时突变的材料恢复育性。Chen等通过基因编辑技术，对玉米的育性相关基因MS8进行了编辑，得到新的玉米雄性不育系(Chen et al.2018)。通过基因编辑技术创造棉花雄性不育系应是一个便捷有效的手段。

发明内容