[发明专利]一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明经筛选得到一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18516。此细胞株分泌的单克隆抗体，对硫酸多粘菌素B具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为13.13ng/mL），可实现对饲料及畜禽食品中硫酸多粘菌素B残留量的检测，为食品中硫酸多粘菌素B残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

硫酸多粘菌素B (多粘菌素B) 英文名：Polymyxin B Sulfate (PMB)，是由多粘芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素。PMB为白色结晶性粉末，易溶于水，有引湿性，在酸性溶液中稳定，其中性溶液在室温放置一周不影响效价，在碱性溶液中不稳定。多粘菌素B抗菌谱及临床应用与多粘菌素E相似，对革兰氏阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用。临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、以及眼、气管、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。同时在畜禽养殖中也用作饲料添加剂，且有明显促生长作用。

多粘菌素B、E一直用作抗菌药物的最后一道防线。但是，在2016年中国首次报道了针对多粘菌素的耐药性基因MCR-1，随后MCR-1被报道存在于30多个国家和地区。据报道，早在1980年代中期，MCR-1就存在于大肠杆菌中，并且在动物饲料中使用粘菌素可能加速了MCR-1在动物中的传播，随后传至人类。然而，由于粘菌素抗菌谱广，促生长作用显著，一些养殖者仍非法在饲料中添加粘菌素。因此，为了阻止MCR-1的传播，维护消费者的利益，有必要建立一种针对PMB的可靠、高效、快速的检测方法。酶联免疫法（ELISA）具有前处理简单，成本低，可实现大量样品的现场快检等优势，但建立此方法的一个重要前提是需筛选出针对硫酸多粘菌素B的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对硫酸多粘菌素B具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立硫酸多粘菌素B的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18516。

硫酸多粘菌素B单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.18516的硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17分泌产生。

所述硫酸多粘菌素B单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中硫酸多粘菌素B残留的分析检测。

杂交瘤细胞株OVA17的制备方法：其通过硫酸多粘菌素B的完全抗原免疫小鼠后，经过培养筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株OVA17。

本发明提供的硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17的制备基本步骤为：

（1）半抗原的制备：半抗原PMB的结构式如下：

原药 Mol. Wt: 1301.56

由于PMB化学结构式中含有多个活泼基团（氨基），因此本发明将原药直接作为半抗原；

（2）完全抗原PMB-GMBS-BSA的制备：采用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯（GMBS）双功能交联剂将PMB半抗原与载体蛋白偶联以制备完全抗原。具体步骤为：