[发明专利]一种外周血中的肿瘤细胞株数量的检测方法

权利要求书

1.一种外周血中的肿瘤细胞数量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外周血样本的获得

採用体表浅静脉负压采血法抽取静脉血，

2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠

3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集

采集人的外周血于任何一种含抗凝剂的采血管中，离心后，去掉血浆蛋白，向其中加入包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后，颠倒混匀,室温孵育，

加细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有细胞分离介质上方隔离液的离心管，将样品标本再次离心，取上清液，将上清液再离心，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞，

4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外周血样本的获得

採用体表浅静脉负压采血法抽取静脉血，

2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠

3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集

采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)，离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，

向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，

加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，

取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，

弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞，

4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外周血样本的获得

採集6mL健康人外周血

2)向外周血样本注入20-40颗仿细胞荧光圆珠及20-40颗细胞株

3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集及鉴别

离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，

向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，

加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，

取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，

弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的细胞株，

对富集到的细胞进行免疫荧光细胞化学染色，通过PE标记的抗人CD45抗体(PE-anti-CD45)和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，加上CEP8荧光探针对染色体线粒体的原位杂交

4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠及细胞株，根据计算公式计算圆珠回收率及细胞株回收率，荧光圆珠回收率与细胞株回收率应该一致。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外周血样本的获得

采集6mL受测者外周血

2)向外周血样本注入20-40颗仿细胞荧光圆珠

3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集

离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，

向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，

加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，

取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，

弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的细胞株，

对富集到的细胞进行免疫荧光细胞化学染色，通过PE标记的抗人CD45抗体(PE-anti-CD45)和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，加上CEP8荧光探针对染色体线粒体的原位杂交，

4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肿瘤细胞的数目。