[发明专利]一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法

权利要求书

1.一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制固体培养基：N6+10%椰汁+2%蔗糖+0.65%琼脂，pH6.0，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，将成熟且无开裂的金钗石斛果荚经表面消毒后，将种子均匀播撒到培养基中，以种子之间不重叠为宜，培养30天；

（2）配制原球茎增殖固体培养基：N6+0.5%海藻提取液+10%椰汁+3%蔗糖+0.65%琼脂，pH6.2，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，将已萌发的种子接种到原球茎增殖固体培养基中，培养35天，完成原球茎培养；

（3）配制液体培养基：N6+0.1%花宝2+0.5%海藻提取液+10%土豆+6%香蕉+3%蔗糖，pH6.2，将1000mL培养基装入三角瓶中，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，将10g金钗石斛原球茎接种到三角瓶中，培养4天；

（4）将间歇浸没培养系统中的罐体组装并包扎灭菌，灭菌后冷却备用，无菌环境下已培养4天且无污染原球茎连同液体培养基倒入间歇浸没培养系统生长室中，培养基流入储液室内、原球茎均匀分布到生长室的育苗盘上，将接种完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为10min/4h，在培养室中培养35天，完成壮苗培养；

壮苗培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力动力系统提供气体气压的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全进入到生长室，并保持10min；第四阶段，浸没结束，在重力及罐体顶部的大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，4h后继续下一次循环；

（5）配制生根培养的液体培养基：N6+0.15%花宝2+10%香蕉+6%土豆+3%蔗糖+1.5%AC ，pH6.5，将1000mL装入三角瓶中，121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，在无菌操作台中将间歇浸没系统罐体原有的培养基倒出，不移动组培苗，将新的1000mL生根培养的液体培养基倒入，完成培养基更换，进入生根培养阶段，将更换完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为10min/4h，在培养室中培养60天，完成生根培养；

生根培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力动力系统提供气体气压的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全进入到生长室，并保持10min；第四阶段，浸没结束，在重力及罐体顶部的大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，4h后继续下一次循环；

（6）整个培养过程培养室环境光照强度2000 lux，光照时间14 h/d，温度25±1℃；

间歇浸没系统，包括罐体（1）、动力系统（2）和控制系统（3），动力系统（2）产生气体通过连接的管道提供给罐体（1），控制系统（3）通过电路连接动力系统（2）；罐体（1）分为上下结构，通过育苗盘（4）密封相隔，上部分为生长室（5）、下部分为储液室（6），两室通过连接在育苗盘（4）上的导管相连；动力系统（2）提供气体气压可以将液体培养基从储液室（6）顺着导管压入到生长室（5），而气体气压消失后液体培养基在重力和大气空气压力作用下通过导管回流到储液室（6 ）中；控制系统（3）控制动力系统（2）的工作；动力系统为气泵、控制系统为时控器；罐体（1）内外气体是等压的，通气阶段多余的气体和停止通气后外界的空气从罐体（1）顶部左侧的扁圆的空气过滤除菌的装置排出和进入，以保持管内的无菌。