[发明专利]一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因工程领域，该重组融合蛋白由犬干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成，柔性linker为(Gly₄Ser)₃连接肽。本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，包括：步骤一、CaIFNα突变表达载体构建；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组CaIFNα‑Mut/RTB融合蛋白表达；步骤四、纯化与复性。该重组融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。该重组融合蛋白比普通犬干扰素α半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了干扰素制剂成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的潜力和价值。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)，一种由生物细胞产生的具有多种功能的糖蛋白，具有广谱的抗病毒作用，是宿主防御病原侵入的主要防线。干扰素本身不能直接杀灭病毒，而是通过诱导宿主细胞合成抗病毒蛋白，增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活性，调节宿主免疫功能，发挥其抗病毒作用。根据产生干扰素的来源不同、理化性质不同、生物活性不同以及识别受体不同，IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。其中，Ⅰ型IFN抗病毒活性较强。Ⅰ型IFN还可分为IFN-α、IFN-β和IFN-ω。目前兽医临床使用的犬干扰素均为IFN-α。但是，干扰素在临床中存在半衰期段、体内易降解、慢性病毒感染等难题，限制了干扰素的临床应用。

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA和RTB两个肽链以二硫键共价连接。其中RTB由262个氨基酸组成。RTB单独存在时没有毒性。目前认为RTB主要有两个功能：1、帮助RTA转运至细胞质内，抑制蛋白质合成；2、RTB增强机体免疫反应。

目前，将犬IFN-α突变体与蓖麻毒素B链蛋白组成融合蛋白来提高融合蛋白抗病毒活性及延长融合蛋白半衰期的研究还未见报道。

发明内容

本发明提供一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，该重组融合蛋白由犬干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成。

作为优选的实施方式，所述犬干扰素α突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-CaIFNα/RTB为模板，将犬干扰素α序列中第34位酪氨酸突变为天冬氨酸，第67位氨基酸脯氨酸突变为亮氨酸，第121位氨基酸精氨酸突变为酪氨酸，将突变后的序列命名为CaIFNα-Mut/RTB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

作为优选的实施方式，所述定点突变引物的序列如下：

SiteⅠ

Sense：5’-TTATACCGACGATTTTGCATT-3’；

Anti-sense：5’-GGAATGCAAAATCGTCGGTATA-3’；

SiteⅡ

Sense：5’-GTGTTTCATCTGATTTGTCC-3’；

Anti-sense：5’-TATCCGGACAAATCAGATGAAAC-3’；

SiteⅢ

Sense：5’-TGCGCACCCGTTTTCAGCGCATTAG-3’；

Anti-sense：5’-TAATGCGCTGAAAACGGGTGCGCAG-3’。