[发明专利]基于锁核酸修饰的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法

权利要求书

1.一种对目标区域基因突变进行富集的方法，其特征在于，包括：

(1)将含有待检测目标区域的核酸样本和第一引物、第二引物和阻滞扩增序列混合，进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；

(2)基于所述第一扩增产物，利用所述第一引物和第三引物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物；

其中，所述阻滞扩增序列的3’末端含有阻滞基团，所述阻滞扩增序列和所述第一引物含有部分重叠序列，

所述待检测目标区域位于所述阻滞扩增序列与所述核酸样本的匹配区域内，所述第一引物的3’末端位于所述待检测目标区域的上游，

所述阻滞扩增序列上修饰有锁核酸，携带有所述锁核酸的碱基位于与所述待检测目标区域匹配的位置。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列的Tm值高于所述第一引物的Tm值。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列的Tm值为60摄氏度～70摄氏度，优选为60摄氏度，所述第一引物的Tm值为55摄氏度～60摄氏度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列去除所述部分重叠序列后序列的Tm值高于所述第一引物去除所述部分重叠序列后序列的Tm值。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞基团包括选自磷酸基团、间臂C3、间臂C5、倒置A、倒置G、倒置C、倒置T或者与所述待检测目标区域不匹配的核酸序列中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列的碱基长度为10bp～40bp，所述第一引物的碱基长度为15～30bp，所述部分重叠序列的碱基长度为3～20bp。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待检测目标区域基因突变频率在1％以下，所述第二扩增产物中待检测目标区域基因突变频率达到50％以上；

任选地，所述第二扩增产物的丰度大于10％，指示所述待检测目标区域存在突变；

所述第二扩增产物的丰度不超过10％，指示所述待检测目标区域不存在突变。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸样本为循环肿瘤DNA；

任选地，所述基因突变包括选自碱基置换突变、移码突变、碱基缺失突变和碱基插入突变。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标区域为EGFR L858R突变，所述第一引物为SEQ ID NO:1，所述第二引物为SEQ ID NO:2，所述阻滞扩增序列为SEQ ID NO:3，所述第三引物为SEQ ID NO:4。

10.一种对目标区域基因突变进行检测的方法，其特征在于，包括：

基于权利要求1～9中任一项所述的方法对目标区域基因突变进行富集，以便获得富集产物；

将所述富集产物进行建库、测序，基于所述测序结果，确定所述目标区域的基因突变；

任选地，所述测序为高通量测序或者一代测序。