[发明专利]基于锁核酸修饰的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法

说明书

本发明涉及一种利用锁核酸修饰对目标区域基因突变进行富集和检测的方法。该富集方法包括：将含有待检测目标区域的核酸样本和第一引物、第二引物和阻滞扩增序列混合扩增，获得第一扩增产物；基于第一扩增产物利用第一引物、第三引物扩增获得第二扩增产物；阻滞扩增序列的3’末端含有阻滞基团，阻滞扩增序列和第一引物含有部分重叠序列，所述待检测目标区域位于阻滞扩增序列与核酸样本的匹配区域内，第一引物的3’末端位于所述待检测目标区域的上游，所述阻滞扩增序列上修饰有锁核酸，携带有所述锁核酸的碱基位于与所述待检测目标区域匹配的位置。由此可以实现对于低频基因突变的高精度检测。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种利用锁核酸修饰对目标区域基因突变进行富集和检测的方法，尤其涉及一种基于锁核酸修饰的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法。

背景技术

随着时代和科技的快速发展，癌症治疗观念正在发生根本性的改变。国际抗癌联盟认为，1/3的癌症是可以预防的，1/3的癌症如能早期诊断是可以治愈的，1/3的癌症可以通过正确治疗减轻痛苦，延长生命。癌症的治疗手段也由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向性治疗模式转变。早期传统的治疗方式为手术切除、化疗和放疗，其中化疗和放疗不能区分肿瘤细胞和正常细胞，对人体伤害较大。肿瘤靶向治疗技术能够在无创或微创条件下以肿瘤为目标，采用有选择、针对性较强、患者易于接受、反应小的局部或全身治疗，最终达到有效控制肿瘤的目的，对人体伤害较小。

现代的癌症精准医疗就是在患者确诊癌症后进行基因检测来确定基因突变种类，寻找适用于该种突变的靶向治疗药物，最后通过结合患者临床表现来制定正确的靶向治疗方案来治疗癌症。基因检测作为靶向治疗的上游事件，对指导整个靶向治疗方案起到十分重要的作用。起初，我们使用肿瘤组织作为基因检测的材料，但是因为获取肿瘤组织对人体伤害较大，部分患者的状况不适宜获取肿瘤组织等原因，我们使用血液作为替代的基因检测材料。

1948年，人们首次发现人体血液中存在游离DNA(cfDNA)，这是一种以单链或双链DNA或DNA蛋白复合物形式存在于血液、脑脊液中的一种胞外DNA。在肿瘤患者体内，由肿瘤细胞坏死、凋亡后释放入血液中的游离DNA片段称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA片段大小一般为160-180bp左右，半衰期为16min-2h不等。由于ctDNA携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现，因此，ctDNA相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点，具有广泛前景。

目前，市面上的许多的ctDNA检测技术，包括NGS检测技术、基于Arms原理的qPCR检测技术以及数字PCR等。其中NGS检测最为广泛。ctDNA检测除了在指导靶向治疗上起到重要作用，在癌症的术后监控以及癌症的早期筛查方便也具有巨大的潜力，但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。首先，血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，ctDNA占总游离DNA只有0.1％-10％，而在癌症术后病人和早期癌症病人的血液中ctDNA占比还要更低的多。所以，目前急需一种既能完成低频突变位点检测又能达到一定通量的ctDNA检测技术，市面上主要存在的这几种ctDNA检测技术均不能满足要求。这种一定通量的低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种利用锁核酸修饰对目标区域基因突变进行富集和检测的方法，该方法利用锁核酸修饰的阻滞物进行阻滞取代扩增富集和检测，以此来实现低频基因突变的高精度检测。