[发明专利]一种提高基因编辑效率的融合蛋白及其应用

说明书

本申请公开了一种提高基因编辑效率的融合蛋白及其应用。所述融合蛋白包括单链DNA结合蛋白功能域、核苷脱氨酶和核酸酶。根据CBEs行使C‑G到T‑A碱基转换过程中，核苷脱氨酶如胞嘧啶脱氨酶以单链DNA为底物进行脱氨，通过将核苷脱氨酶和核酸酶的融合蛋白上再融合单链DNA结合蛋白功能域，大大增加了单链DNA暴露于核苷脱氨酶的机会，从而明显提高了碱基编辑效率。本发明对单碱基基因编辑技术进行了突破性的改进，可以极大地促进其在基因编辑、基因治疗、细胞治疗、动物模型制作、作物遗传育种等方面的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种提高基因编辑效率的融合蛋白及其应用。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，改变了传统的基因操作手段。2016年4月，David Liu实验室首次报导单碱基基因编辑技术，之后，基于胞嘧啶脱氨酶原理的其它类型的单碱基基因编辑技术(如来源于七鳃鳗和人的胞嘧啶脱氨酶以不同方式与dCas9或Cas9n融合)也相继被报道。它以CRISPR/Cas9中来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9以NGG作为PAM并识别和特异结合DNA在NGG上游实现C到T或G到A的单碱基突变。

单碱基基因编辑技术，已被报导可用于高效地进行基因组的基因突变或修复、疾病动物模型制作、基因治疗。目前，已发现的单碱基基因编辑工具中，以BE3(碱基编辑器3)应用最为广泛。BE3以最高达37％的碱基替换效率，远远高于利用同源重组实现的效率，同时保持较低的脱靶效应，展现出其在用于基因组的单碱基突变修饰或单碱基突变治疗的巨大潜力。随着研究的深入，发现引入额外两个或者更多拷贝的UGI(尿嘧啶糖苷酶抑制剂)到BE3可进一步增强其编辑效率及产物纯度。引入双分型NLS(核定位信号)和密码子化即BE4max，其编辑效率被一步提高。这些方法均一定程度提高其效率，但都比较有限。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种提高基因编辑效率的融合蛋白及其应用。

一方面，本发明提供了一种提高基因编辑效率的融合蛋白，包括单链DNA结合蛋白功能域、核苷脱氨酶和核酸酶。

具体的，所述融合蛋白的连接顺序为：所述核苷脱氨酶位于所述核酸酶的N端或C端，所述单链DNA结合蛋白功能域位于所述核苷脱氨酶和所述核酸酶的N端、C端和/或所述核苷脱氨酶和所述核酸酶之间；

优选的，所述核苷脱氨酶位于所述核酸酶的N端；

更优选的，所述单链DNA结合蛋白功能域位于所述核苷脱氨酶和所述核酸酶之间。

在上述融合蛋白中，所述单链DNA结合蛋白包括序列特异性单链DNA结合蛋白、和/或非序列特异性单链DNA结合蛋白，优选，非序列特异性单链DNA结合蛋白，

优选的，所述非序列特异性单链DNA结合蛋白选自RPA70(人复制蛋白A的70亚基)、RPA32(人复制蛋白A的32亚基)、BRCA2(乳腺癌2号基因)、hnRNPK(异质核核糖核蛋白K)、PUF60(聚-U结合剪接因子60KDa)和Rad51(一种同源重组修复蛋白)中的任一种或任几种；

优选的，所述序列特异性单链DNA结合蛋白选自TEBP(端粒结合蛋白)、Teb1(一种端粒酶的组成蛋白)和POT1(人端粒保护蛋白1)中的任一种或任几种；

优选的，所述单链DNA结合蛋白功能域包括如下四种结构域中的至少一种(任一种、任两种、任三种或全部四种)或如下四种结构域中具有与单链DNA结合功能的部分多肽片段及其任意组合：所述单链DNA结合蛋白的OB折叠(寡核苷酸/寡糖/寡肽结合折叠)、KH结构域(K同源结构域)、RRMS(RNA识别基序)、涡状结构域(whirly domains)；