[发明专利]一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用，所述方法包括以下步骤:S1，根据甘蓝型油菜BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；S2，构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体；S3，pBnaSAD2载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得油菜种子脂肪酸组成发生改变的突变体，上述突变植株的种子脂肪酸组成发生了显著变化。本发明所提供的方法可以不同程度改变油菜种子脂肪酸组成，为改变甘蓝型油菜种子脂肪酸组成提供了新的途径、提供了新的种质资源，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用。

背景技术

油菜是我国重要的油料作物和食用植物油来源，油菜的脂肪酸改良主要是从不同的用途展开，其中最受关注的是提高油菜油酸含量，改善菜籽油的品质，但是关于对油菜种子中脂肪酸组成的遗传改良研究很少有报道，到目前为止，尚未有利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对甘蓝型油菜硬酯酰基去饱和酶(S-ACP-D)基因进行突变改变油菜种子脂肪酸组成(C18∶0)及应用的报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及应用。该方法首先根据拟南芥fab2基因对甘蓝型油菜硬酯酰基去饱和酶(S-ACP-D)基因家族进行分析，得到甘蓝型油菜中该基因的四个拷贝，通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaSAD的四个拷贝精确定点突变，最终获得了种子脂肪酸组成改变的突变体。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供了一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法，包括以下步骤：

S1，根据甘蓝型油菜BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；

S2，构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体；

S3，pBnaSAD2载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得油菜种子脂肪酸组成发生改变的突变体。

其中，所述五个碱基位点的靶点序列(5＇-3＇)分别见SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。

其中，所述靶点序列的引物序列分别见SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20。

其中，所述BnaSAD.C4拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述BnaSAD.A5拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：3所示；所述BnaSAD.A3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述BnaSAD.C3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明步骤S3中构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体的步骤包括：

a.靶点接头制备；

b.靶点接头引物与sgRNA表达盒的连接和扩增；

c.靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接；

d.转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证，得到最终载体；

e.将连接成功的载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，得到pBnaSAD2载体农杆菌菌株。