[发明专利]从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法

说明书

本发明公开了从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，涉及基因检测技术领域。该方法包括：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；粪便稀释液中的粪便取自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测的主体；离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL。该提取方法操作简单，粪便用量少，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取效果好，所提取的DNA样本用于后续甲基化检测时具有较好的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。

背景技术

结直肠癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤，我国每年新增发病人数约40万，其发病率居所有恶性肿瘤的第三位。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，且大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。

肠镜检查是结直肠癌检测和确诊的金标准，但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，因此在一般人群中的普及率很低。无创检测方法如粪便潜血检查(FOBT)和粪便免疫化学检查(FIT)的灵敏度不高，尤其是在检测I期结直肠癌和进展期腺瘤方面灵敏性较低。甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。粪便中含有一定量的肠道脱落细胞，因此可通过检测这些脱落细胞中的某些DNA靶标继而对肠道的健康状况进行评估。越来越多的研究指出，粪便DNA甲基化检测在结直肠癌无创筛查方面显示出很大的优势，其灵敏性和特异性均优于血液甲基化检测和粪便潜血检测。2014年，FDA批准了第一款结直肠癌粪便DNA检测试剂盒Cologuard，该试剂盒可以同时检测粪便中的血红素、KRAS基因突变及另外两个基因的甲基化，其对结直肠癌的检测灵敏性和特异性分别为92％和87％。

良好的粪便DNA检测效果依赖于上游的粪便处理技术，包括粪便保存和粪便DNA提取等。现有的粪便DNA提取技术种类繁多，按照提取基因组的范围来分，可分为提取全部DNA的方法和靶向富集提取特定DNA的方法；按照提取试剂的种类，可分为机械法、磁珠法和化学法等。应当指出的是，不同的提取方法适用于不同的应用场景，产生的检测效果也不同。

粪便基质成分非常复杂，其中含有种类众多的细菌基因组DNA、植物来源DNA和动物来源DNA，肠道或其他消化道位置的脱落细胞含量相对较少，不仅如此，粪便中还含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，此时如果采用从粪便中提取全部基因组的做法(如现有技术CN201611113440)，庞大的基因背景和PCR抑制物将非常不利于肿瘤脱落细胞DNA的检测；现有技术CN201710332851使用探针富集人类基因组，虽然在一定程度上特异性地区分了人类基因组和其他基因组，但是仍未实现对人类特定基因的富集，且某些肿瘤来源的DNA片段化较严重，不能通过对人类基因组的整体富集实现对特定肿瘤基因的富集；另外，现有技术中还存在使用粪便量较多、要用到有机溶剂等问题，如CN201811636712，虽然使用较大的粪便量可能会增加目的基因的提取量，但这也不可避免地增加了步骤的繁琐性和成本：需要使用到特定的试剂耗材(如5mL、15mL和50mL离心管)和设备(大型离心机等)。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。该提取方法操作简单，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取成本低；所提取的DNA样本用于后续检测中具有较好的灵敏度和特异性，提取效果好。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测，其包括：