[发明专利]一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，所述试剂盒包括：

1)扩增反应液：含40mM pH 8.0的Tris-HCl，12mM MgCl₂，70mM KCl，15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括五组：呼吸道合胞病毒A型和B型共用一条R，各一条F引物、副流感1、2、3型病毒和人内参基因各一对R和F引物，具体的：

(1)呼吸道合胞病毒的扩增引物：

RSV-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCA AA3’；

RSVA-F引物：5’TGTTATAGGACTTTCTTT3’；

RSVB-F引物：5’AGTGACTTCTATGTCTAT3’；

(2)副流感病毒的扩增引物：

PIV1-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGATTGTAAAAAG CAAGATT3’；

PIV1-F引物：5’GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3’；

PIV2-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTAC TTATT3’；

PIV2-F引物：5’CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3’；

PIV3-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATC CTG3’；

PIV3-F引物：5’TCACTTTCTCAGTTAATAT3’；

(3)内参基因的扩增引物：

内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCA GCTAAGAGCA3’；

内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’；

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；

3)细胞裂解液；

4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

(1)金探针：

金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：

5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGC TCGAGCACTGCG-3’；

(2)RSVA特异探针序列：

RSVA-LES1:5’TTGACAGATATGATACTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC3’；

RSVA-LES2:5’TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC3’；

RSVA-LES3:5’TTGGGTGATGTGAATTTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC3’；

RSVA-LES4:5’CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC3’；

RSVA-LES5:5’AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC3’；

RSVA-CES:5’ACTTCTATATCTATTGAGTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCC CA3’；

(3)RSVB特异探针序列：

RSVB-LES1：5’TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCGCAGTGCTC GAGCTCTGAGC3’；

RSVB-LES2：5’GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCGCAGTGCTC GAGCTCTGAGC3’；

RSVB-LES3：5’GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；

RSVB-CES：5’TTGACAGATATTATGCTATCTTTTGGCCTCTAAGTCGTAG CCCA3’；

(4)PIV1特异探针序列：

PIV1-LES1：5’TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

PIV1-LES2：5’TAGCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCGCAGTGCTCGAGC TCTGAGC3’；

PIV1-CES：5’TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTATCGACGTGGTAGGCAT AGACGTACT3’；

(5)PIV2特异探针序列：

PIV2-LES1：5’TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；

PIV2-LES2：5’CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；

PIV2-CES：5’TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTATCGACGTGGTAGGCA TAGACGTACT3’；

(6)PIV3特异探针序列：

PIV3-LES1：5’GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

PIV3-LES2：5’AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCGCAGTGCTCGAGC TCTGAGC3’；

PIV3-CES：5’TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTATCGACGTGGTAGGCAT AGACGTACT3’；

(7)人内参基因特异探针序列：

内参LES1:5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；

内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTTGTGGAAGATTATAGC3’；

内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTGTGGAAGATTATAGC3’；(8)C线显色探针序列：

5’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

5)试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有质控线C线和三条检测线T线，从样品垫到吸水纸方向分别为RSV-T、PIV-T、内参-T和C线；PIV-T处包被PIV包被探针、RSV-T处包被RSV包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：

C线包被探针序列：

5’GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA 3’；

内参线包被探针序列：

5’GCTATAATCTTCCACTTTTGCTATAATCTTCCAC3’；

PIV线包被探针序列：

5’AGTACGTCTATGCCTACCACGTCGATTTTTAGTACGTCTATGCCTACC ACGTCGAT3’；

RSV线包被探针序列：

5’TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTTGGGCTACGACTTAGAGGCC3’。