[发明专利]一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)扩增反应液：含40mM pH 8.0Tris-HCl，12mM MgCl₂，70mM KCl，15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM，其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：

(1)甲型流感病毒的扩增引物：

FluA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTC CAGGGGCGGG；其中，H＝A/T/C；

FluA-F引物(5’-3’)：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；

(2)乙型流感病毒的扩增引物：

FluB-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTG GTTCGGTGGGA；

FluB-F引物(5’-3’)：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；

(3)内参基因的扩增引物：

内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGA CTTGCCCTCCA；

内参-F引物(5’-3’)：AGAAACGGCTACCACATCC；

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；

3)细胞裂解液；

4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列(5’-3’)为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCG CAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；

5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体(5’-3’)如下：

(1)甲型流感病毒特异探针

甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttCTGTACGTATGTATGT；

甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttCTGTACGATTGTATGT；

其中，Y＝T/C；

甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

其中，R＝A/G；

甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；(2)乙型流感病毒特异探针

乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttttCTGTACGTATGTATGT；

乙流CES2：CTGCCTTGGAATGGATAAttttCTGTACGATTGTATGT；

乙流LES1：AAAACAAAAGATGCTTAAttttCATGAGAACGCGAACGTGG T；

乙流LES2：CTGATATACAGAAAGCACttttCATGAGAACGCGAACGTGG T；

乙流LES3：TAATTGGTGCATCTATCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；(3)内参特异探针

内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttCTGTACGTATGTATGT；

内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttCTGTACGATTGTATGT；

内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

6)微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列(5’-3’)为：ACATACATACGT ACAG；

7)HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物；

8)配制杂交液、5×洗液A、5×洗液B、封闭液、底物稀释液；所述杂交液：含0.1％SDS的5×SSC；5×洗液A：含0.5％SDS的5×SSC；5×洗液B：含0.5％SDS的5×PBS；封闭液：含0.5％BSA、1×PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5Tris-HCl；

9)底物：鲁米诺化学发光底物，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。