[发明专利]一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用。将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中，同时加入特异探针及放大探针，其中包被探针可与特异探针CES的一端结合固定扩增产物RNA；特异探针LES的一端结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素‑HRP酶联物结合，最后加入HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。本发明无需RNA提取，在检测中不易污染，灵敏度高、特异性强，可广泛用于甲、乙型流感病毒核酸检测。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于双扩增(RNA恒温扩增+多生物素信号放大)技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。

背景技术

流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为18个H亚型(H1-H18)和11个N亚型(N1-N11)，目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有感染人的报道。由于编码HA和(或)NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和(或)NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移(antigenic drift)。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人(65岁)和婴幼儿(6岁)。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亚型。近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感(H5亚型)病毒的病例时有报道，禽类甲型H5N1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变(antigenic shift)。新型甲型H1N1流感病毒(2009)即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。

流感病毒传播途径主要以空气飞沫传播为主，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断。现在常用的甲乙型流感病毒核酸检测都是基于RT-PCR的方法，这些方法需要复杂的RNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和荧光定量PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。因此在RNA恒温扩增技术的基础上，结合多生物素信号放大技术，建立单管联合检测甲、乙型流感病毒核酸的方法具有非常重要的意义。

发明内容