[发明专利]一种柔红霉素衍生物及其制备方法与柔红霉素检测试剂

权利要求书

1.一种柔红霉素衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：

2.一种如权利要求1所述的柔红霉素衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法的具体路线如下所示：

3.一种柔红霉素均相酶免疫检测试剂，其特征在于，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含抗柔红霉素特异性抗体1与R1缓冲液，所述R2试剂包含柔红霉素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；所述抗柔红霉素特异性抗体1为柔红霉素血蓝蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体；所述的柔红霉素血蓝蛋白免疫原，由权利要求1所述的柔红霉素衍生物与血蓝蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅱ所示：

所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种；

所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型；

所述的柔红霉素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的柔红霉素衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：

所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。

4.一种如权利要求3所述的柔红霉素均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含以下步骤：

(1)将0.25％牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗柔红霉素特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用6mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R1试剂；

(2)将0.25％牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将柔红霉素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用6mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R2试剂；

所述抗柔红霉素特异性抗体1的制备方法，包含以下步骤：

a.将柔红霉素血蓝蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

b.1-4周后，再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；

c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗柔红霉素特异性抗体1；

所述的柔红霉素血蓝蛋白免疫原的制备方法，包含以下步骤：

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液A；

b.称取3.0-6.0mg血蓝蛋白，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液A中，制成血蓝蛋白载体溶液；

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的柔红霉素衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液A中，制成柔红霉素衍生物溶液A；

d.当上述柔红霉素衍生物溶液A刚变澄清时，将其逐滴加入上述血蓝蛋白载体溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析，透析后所得溶液即为柔红霉素血蓝蛋白免疫原溶液，在柔红霉素血蓝蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20％的硫柳汞，于-20℃下储存；

所述的柔红霉素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：

a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液B；

b.称取3.0-6.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，0-8℃下溶解于3.0-6.0mL上述缓冲溶液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的柔红霉素衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液B中，制成柔红霉素衍生物溶液B；

d.当上述柔红霉素衍生物溶液B刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析，透析后所得溶液即为柔红霉素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液，在柔红霉素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0％的BSA和质量分数0.05-0.20％的硫柳汞，于0～8℃下储存。