[发明专利]同时检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲脲原体核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)扩增反应液：含pH 8.0的40mM Tris-HCl，12mM MgCl2，70mM KCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.25μM；其中扩增引物包括四对：淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和人内参基因，所述引物从5’端到3’端的核苷酸序列依次为：

(1)淋病奈瑟菌的扩增引物：

NG-引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGCACCGGTAACCACT；

NG-F引物：ACACCAGGTTCACCGTTTG；

(2)沙眼衣原体的扩增引物：

CT-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCTAGATTTCATCTTGC；

CT-F引物：GGGATCGYTTTGCTGTAT；

其中，Y＝T/C；

(3)解脲脲原体的扩增引物：

UU-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGGTTCACGWGGTAATT；

其中，W＝A/T；

UU-F引物：GTATTTGCACTCTTTATA；

(4)内参基因的扩增引物：

内参-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTATATTACGACCAAGCT；

内参-F引物：CCAGTTCTGGCTGCATGTA；

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；所述逆转录酶为AMV或M-MLV；

3)细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；

4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针和特异探针的LES系列的一端结合，所述探针从5’端到3’端的核苷酸序列为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；

5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列设计成多条，所述探针从5’端到3’端的核苷酸序列依次为：

(1)淋病奈瑟菌特异探针

NG-CES1：TTACTCTTGTTGGAGAAttttCTGTACGTATGTATGT；

NG-LES1：GGCATGCCTTGTTGGATCCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

NG-LES2：CCGTGAAGCGTTAGTCATttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

NG-LES3：ATGCGACAGCAAGTCACGttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

(2)沙眼衣原体特异探针

CT-CES1：TTGAAGACGGTGTCGATCttttCTGTACGTATGTATGT；

CT-CES2：CCGTGTAGCCCTGCGTAGttttCTGTACGATTGTATGT；

CT-LES1：GATTTGACGGCATGGTCAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

CT-LES2：CTCACTAAGAAGGCTGTCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

CT-LES3：AGTGTCCATCGTGTTCGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

(3)解脲脲原体特异探针

UU-CES1：GTTTCAACGTATCCAACCttttCTGTACGTATGTATGT；

UU-CES2：CCCTTAAGGGTTACATAAttttCTGTACGATTGTATGT；

UU-LES1：ATGGCAATGATTAGCTAAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

UU-LES2：CCGAATAATTTGGCATCAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

UU-LES3：CGGCATGGAAGATGTAGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

(4)内参特异探针

内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttCTGTACGTATGTATGT；

内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttCTGTACGATTGTATGT；

内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；

6)微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，所述探针从5’端到3’端的核苷酸序列为：ACATACATACGTACAG；

7)HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；

8)配制杂交液、5×洗液A、5×洗液B、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1％SDS的5×SSC；5×洗液A：含0.5％SDS的5×SSC；5×洗液B：含0.5％SDS的5×PBS；封闭液：含0.5％BSA、1×PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5Tris-HCl；

9)底物：购至Thermo Fisher，货号37075鲁米诺化学发光底物，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。

2.权利要求1所述的试剂盒在制备淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲脲原体检测试剂中的应用。