[发明专利]一种达托霉素的纯化方法

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体公开一种达托霉素的纯化方法。包括如下步骤：1)陶瓷膜过滤达托霉素发酵液；2)疏水树脂层析；3)离子交换树脂层析；4)疏水树脂层析除盐、除内毒素；5)纳滤浓缩；6)冷冻干燥。本发明所提供达托霉素的纯化方法，操作简单，步骤短，生产周期短，产品收率高，达托霉素纯度高，有利于规模化生产。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种达托霉素的纯化方法。

背景技术

达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取得到的环脂肽类物质，最初是由美国Lily公司于80年代开发，1997年11月，Lily公司将达托霉素的全球独家开发、生产及销售权转让给Cubist制药公司，2003年9月12日，FDA首次批准Cubicin(Daptomycin注射剂)上市。它是获准上市的首个环脂肽类抗生素药物，用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染。2006年达托霉素在澳大利亚，德国，荷兰，西班牙，英国上市，2007年在瑞士上市。随后在加拿大，韩国，欧盟等10多个国家注册。2006年3月美国FDA又批准；达托霉素的新的适应症——用于治疗对甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)或耐甲氧西林金葡菌(MRSA)性菌血症及其引起的右侧心内膜炎。

2000年Pfizer公司研发的利奈唑烷(linezolid)，作为近四十年开发的仅有两类新结构抗生素之一，上市不到一年就出现交叉耐药菌的报道。而达托霉素具有可以赋予其临床优势的数项独特性质。首先，达托霉素的作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同，这意味着达托霉素将不会受到来自其他抗生素所致交叉耐药性的影响，达托霉素作为应用到临床的首个环脂肽类抗生素，至今尚未有交叉耐药菌的报道，临床耐药菌株的出现几率极低(＜0.2％)。其次，达托霉素已经显现能在体外迅速抑制大多数临床革兰阳性球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌。第三，与传统抗生素至少一日2次给药相比，达托霉素仅需一日1次用药，剂量方案明显简化并可有效降低医疗成本支出。基于上述诸因素，此药上市销售市场前景广阔。

目前，国内外已有一些达托霉素的纯化工艺的报道。美国卡比斯特制药公司申请的中国专利CN1404487公开了一种利用阴离子树脂纯化达托霉素的方法，该方法交替使用阴离子树脂FP-DA13、大孔树脂HP-20SS、阴离子树脂PorosD50或Poros 150对达托霉素进行分离提纯，可以得到纯度98％的达托霉素产品，但该工艺繁琐，且成本较高，难以实现工业化规模生产。

中国专利CN101830970和CN102276696A在CN1404487基础上进行了工艺改进，CN101830970A是采用缓冲溶液将达托霉素粗品配成样品溶液，然后上复合型YT-01用反相硅胶材料柱吸附，再用强极性溶剂的水溶液作解吸剂进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；CN102276696A是将半纯化的达托霉素加载结合到凝胶型弱阴离子树脂后进行洗脱。这两个专利技术虽然简化了流程、降低了成本，但难以实现工业化生产。

CN103224547A先将达托霉素发酵液调pH过板框收集菌丝液，菌丝液再经丁醇、磷酸氢二钾溶液反复萃取，萃取液减压浓缩、结晶得达托霉素粗品，粗品再经大孔树脂进行层析分离，解吸液经异丙醇结晶、重结晶得达托霉素精制品，纯度达到99.5％，但是该工艺繁琐，用到了大量的有机溶剂，不利于环保，收率低，不利于工业化生产。

CN102718839A公开了一种分离纯化达托霉素的方法，包括如下步骤：陶瓷膜过滤达托霉素发酵液，大孔吸附树脂层析，纳滤浓缩，疏水树脂柱层析第一步粗分；离子交换树脂柱层析，疏水树脂柱层析第二步粗分，超滤，冷冻干燥得到纯度99.2％以上的达托霉素。此方法缺点是操作步骤长，收率较低。

综上可以看出，达托霉素纯化工艺存在着操作繁琐，步骤长，生产成本高，收率和纯度低等缺陷，因此亟需提供一种操作简单，步骤短，收率和纯度高的达托霉素的纯化工艺。

发明内容