[发明专利]一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种基于RPA‑LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用，该试剂盒包括特异性引物对及探针、侧流层析试纸条；所述探针5’末端的修饰方式为：用FITC进行标记，3’末端的修饰方式为：引入3C‑spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)；所述探针在AP位点前至少要保留30bp的碱基，在AP位点之后至少有15bp的碱基；所述下游引物的5’末端的修饰方式为：标记生物素。本发明优点在于：不依赖实验室设备，能够很好的应用到现场检测中，可实现在25℃‑45℃，20min内快速检测副溶血弧菌。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用。

背景技术

目前，检测副溶血弧菌的常用方法有传统的培养法，免疫诊断，核酸诊断，其中，核酸诊断主要有聚合酶链式反应(PCR)和(LAMP) 两种方法，传统培养法是在我国颁布的国家标准GB/T4789.7—2008 《食品卫生微生物学检验副溶血弧菌检验》中，将送检的样品增菌后进行分离培养，随后对分离培养的可疑菌株进行形态学和生化鉴定，对鉴定结果进行综合评价，确定可疑菌株是否是副溶血弧菌。该方法检测周期长，工作量大，对工作人员实验技能要求高，该实验操作只能在实验室进行，无法进行现场检测。

免疫诊断是结合抗原抗体免疫反应和酶的高效催化反应的一种可视化检测。通过酶降解底物呈现的颜色深浅来判断检测抗原的多少。该方法特异性强，但对试剂的选择性高，灵敏度低，并且容易出现交叉反应。

核酸诊断技术因其特异性强，灵敏度高而受到人们的高度关注，常用的核酸诊断技术主要包括常规PCR扩增和LAMP两大类。据报道 PCR技术用于检测病原体的种类已超过100多种，但是由于要经过三个温度阶段，实验设备要求高且耗时长。因此，PCR技术被局限于实验室研究，不宜做野外实地检测(POCT检测)。与PCR相比，等温扩增技术更简单，快速，其特异性和灵敏度与PCR相当，该技术既克服了传统PCR技术高温变性获得单链模板的缺陷，也避免了升降温的过程，无需温控设备，很大程度上降低了检测成本。

传统的培养法检测副溶血弧菌的检测周期长，工作量大，对工作人员实验技能要求高，该实验操作只能在实验室进行，无法进行现场检测。PCR要经过三个温度阶段，实验设备要求高且耗时长，因此， PCR技术被局限于实验室研究，不宜做野外实地检测(POCT检测)。 LAMP在很大程度上避免了PCR的缺陷，但其自身也存在一定的问题： 1、LAMP引物设计比较复杂，需要2-3对引物；2、LAMP很容易产生假阳性的结果，降低结果的精确度；4、LAMP扩增时间一般在 40min-60min，在一定程度上增加了时间成本。

传统的副溶血弧菌检测方法由于检测时间长，设备依赖性强，对检测人员实验操作技能要求高，因此被局限于实验室检测，不适合进行现场检测。此外，再样本送检过程中会影响样本的质量，对后期检测造成不同程度的影响。因此需要建立一个不依赖于设备的现场快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的检测副溶血弧菌的技术无法很好的应用到现场快速检测中的缺点，而提出的一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用。

本发明涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对，包括特异性引物对以及探针，所述特异性引物及探针的序列为：

上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG

下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG

探针：

5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG ATCA-SpC3