[发明专利]一种条件性定点双过表达HPV E6/E7基因小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种条件性定点双过表达HPV E6/E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1、获得ROSA26位点条件性定点敲入HPV E6小鼠及H11位点条件性定点敲入HPV E7小鼠：

(1)根据HPV E6及E7基因的序列，分别在小鼠ROSA26位点、H11位点设计并获得sgRNA，评估候选序列脱靶效应；

(2)将上述两个序列对应的sgRNA分别与Cas9蛋白共同孵育，分别制备Cas9/sgRNA混合物；

(3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建分别携带条件性过表达E6或E7序列的同源重组载体，构建过程中所用重组系统为Cre-LoxP诱导表达系统，载体包括“启动-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E6或E7-筛选标记-polyA”基因片段；

(4)显微共注射与F0代小鼠获得，分别将上述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至代孕鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠，包括ROSA26位点定点敲入HPV E6的F0代小鼠及H11位点定点敲入HPV E7的F0代小鼠；

(5)F1代小鼠获得，将上述性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后得到F1代阳性杂合子小鼠，包括ROSA26位点定点敲入HPV E6的F1代小鼠及H11位点定点敲入HPV E7的F1代小鼠；

(6)分别将上述ROSA26位点定点敲入HPV E6的F1代阳性杂合子小鼠、H11位点定点敲入HPV E7的F1代阳性杂合子小鼠自交，筛选得到F2代阳性纯合子小鼠；

2、获得条件性定点HPV E6/E7双敲入模型小鼠：

将上述ROSA26位点定点敲入HPV E6 F2代阳性纯合子小鼠与H11位点定点敲入HPV E7F2代阳性纯合子小鼠杂交，获得条件性定点HPV E6/E7双敲入模型小鼠。

2.如权利要求1所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：

条件性过表达HPV16 E6的sgRNA的序列为：

CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGGG，

条件性过表达HPV16 E7的sgRNA的序列为：

GAACACUAGUGCACUUAUCCUGG。

3.如权利要求1所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括：

小鼠基因型鉴定的步骤：采用PCR检测或测序验证，

提取E6小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定，引物ROSA26-seqF1/ROSA26-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组5’进行了有效插入；ROSA26-seqF2/ROSA26-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组3’进行了有效插入；

提取E7小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定。如图19所示，引物H11-seqF1/H11-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组5’进行了有效插入；H11-seqF2/H11-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组3’进行了有效插入。

4.如权利要求3所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，

PCR检测或测序验证所采用的引物序列如下：

E6小鼠：

E7小鼠：