[发明专利]一种条件性定点双过表达HPV E6/E7基因小鼠模型的构建方法

说明书

本发明提供一种条件性定点双过表达HPV E6/E7基因小鼠模型的构建方法，包括步骤：1、(1)分别设计并获得sgRNA，(2)分别制备Cas9/sgRNA混合物；(3)构建打靶载体，(4)显微共注射与F0代小鼠获得，包括ROSA26位点定点敲入HPV E6的F0代小鼠及H11位点定点敲入HPVE7的F0代小鼠；(5)F1代小鼠获得；(6)得到F2代阳性纯合子小鼠；2、获得条件性定点HPV E6/E7双敲入模型小鼠：将两种F2代阳性纯合子小鼠杂交，获得条件性定点HPV E6/E7双敲入模型小鼠。本发明所提供的方法，能够获得一种可稳定遗传、精准调控的动物模型。

技术领域

本发明涉及一种条件性定点双过表达HPV E6/E7基因小鼠模型的构 建方法，属于生物技术领域。

背景技术

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中 仅次于乳腺癌，具有发病过程复杂，发病率高且发病人群趋于年轻化的 趋势，严重威胁女性生命健康。其发生发展是一个复杂、多步骤的过程， 是多种致癌因素长期协同作用的结果，包括人乳头瘤病毒(HPV)感染、 基因变异、免疫逃逸等。大量流行病学及分子生物学研究结果证实，HPV 与生殖道上皮恶性肿瘤与癌前病变密切相关，为宫颈癌的主要病因学因 素。HPV具有高度组织特异性，对鳞状上皮有强嗜性。目前已有200多 种HPV亚型被鉴定，根据其致癌性可分为高危型HPV(hrHPV)与低危型 HPV(lrHPV)。各亚型基因结构大致相似，可分为3个部分：早期(E)编 码区，晚期(L)编码区及长调控区(LCR)。其中，hrHPV E6、E7在HPV 致癌过程中起关键性作用，其编码的蛋白产物是导致宫颈上皮癌变的重 要因子，这两种蛋白通过与细胞内抑癌蛋白P53、pRb结合等方式影响 细胞生长周期与DNA修复，促使上皮细胞退出分化程序，持续增生。 对E6/E7在宫颈癌发生发展过程中的机制、宫颈癌诊疗与疫苗研发等方面开展深入研究具有重要的医学应用价值。

目前，如何全面评价hrHPV E6/E7的促癌机制，尤其是在诱导正常 细胞恶性转化及肿瘤微环境免疫调控等过程中的机理研究尚存在着瓶 颈。为探讨上述科学问题，体内模型的发展是十分必要的，体内环境的 有机整体是研究分子与病变相互作用所需要的。体内hrHPV E6/E7蛋白 的作用可通过相关动物模型的特征来评价，并以此为根据探讨hrHPV与妇女宫颈不典型增生、宫颈癌等发生的关系。目前多利用裸鼠、传统随 机转基因小鼠开展相关研究。

(1)裸鼠：国内研究者通过构建带有角蛋白(K14)启动子的E6/E7 腺病毒载体，尾静脉注射重组病毒Ad-K14-E6/E7至裸鼠体内联合腹腔 注射雌激素等方式，诱导E6/E7在受试小鼠子宫体中的表达。

(2)转基因小鼠：转基因动物是指用实验方法转入的外源基因在其 基因组内整合并表达和传与后代的一类动物，转基因动物打破了物种界 限，为研究不同来源的基因提供了可能。如，研究者通过构建带有皮肤 组织特异性启动子P_INV(Humaninvolucrinpromoter)的HPV16 E6/E7真核 表达载体，线性化后显微注射的方式获得了pINV-E6/E7转基因首建鼠， 阳性后代比例符合孟德尔遗传定律。

在上述模型中，由于裸鼠缺乏健全的免疫系统，该模型不适用于研 究HPV E6/E7在介导肿瘤微环境免疫调控、免疫逃逸等过程中的作用。 而对于传统的随机转基因小鼠，尽管其已在很多领域已经得到应用，但 却依然受到一定限制。转基因的效率及整合位点的不确定性是主要原因。 此类小鼠一般利用质粒进行受精卵原核注射的方式来制备，其整合是随 机的，有的发生于单位点，也有的情况下整合于不同染色体的多个位点 上，其随机性可能造成基因组的重排、易位缺失，外源基因插入可能破 坏小鼠內源基因；此外整合的拷贝数不固定，多拷贝串联整合可能导致 外源基因表达率低甚至不表达，不利于控制基因的表达水平及功能研究。 因此获得首建鼠(基因型鉴定为阳性)后还需进一步筛选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种条件性定点双过表达HPV E6/E7基因小 鼠模型的构建方法，以解决上述问题。