[发明专利]一种检测样品体系中微量蛋白的方法

权利要求书

1.一种检测样品体系中微量蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

提供待测蛋白的一抗修饰的免疫磁珠和二抗修饰的纳米颗粒；

将所述一抗修饰的免疫磁珠和二抗修饰的纳米颗粒与含有所述待测蛋白的样品体系混合孵育，形成双抗夹心结构复合体；

使所述复合体以单颗粒形式通过微纳孔装置并引发电脉冲信号，分析所述电脉冲信号得到所述复合体的电荷状态或体积/质量状态，根据所述电荷状态或体积/质量状态计算所述样品体系中待测蛋白的数量；

所述电脉冲信号反映所述复合体的电荷状态，通过分析所述电脉冲信号的峰波动得到所述复合体中结合的所述纳米颗粒的状态和/或数量，根据所述状态和/或数量以及双抗夹心结构反应原理计算所述样品体系中待测蛋白的数量；

所述体积/质量状态与所述电脉冲信号积分面积正相关，所述复合体上的捕获蛋白数与所述复合体相对于所述免疫磁珠的体积/质量增量成正比，根据所述电脉冲信号积分面积与所述复合体上的捕获蛋白数的标准曲线关系推算所述复合体上的捕获蛋白数，进而计算所述样品体系中待测蛋白的数量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：在适于抗体修饰反应的溶液体系中，使所述一抗与免疫磁珠表面的功能基团共价结合得到所述一抗修饰的免疫磁珠。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，通过调节所述溶液体系中所述一抗与所述免疫磁珠的浓度比例，来调节所述一抗在所述免疫磁珠表面的修饰程度。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述免疫磁珠的粒径至少是所述纳米颗粒的1-1000倍。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述免疫磁珠的粒径为100纳米到10微米，所述纳米颗粒的粒径小于1微米。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微纳孔装置是基于库尔特原理的微纳孔单颗粒计数装置，该装置包括两个充满电解液的腔室，以及联通所述两个充满电解液的腔室的微纳孔，当所述复合体以单颗粒形式通过所述微纳孔时，短暂堵塞离子在所述微纳孔中的流动，形成电脉冲信号。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微纳孔装置是带微孔的双层膜结构装置，该装置包括两层具有设定间隔距离的带微孔的纳米薄膜，两层纳米薄膜上的微孔相对而将所述纳米薄膜两侧的腔体连通，所述腔体内充满电解液，并且两侧的腔体分别布置有用于维持离子传输的电极；当所述复合体以单颗粒形式连续通过两个微孔的过程中产生具有时间间隔的一对电脉冲信号。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：通过调节样品中所述复合体的浓度控制不同复合体间的电脉冲信号间隔远大于电脉冲信号对内的时间间隔，并通过对所述电脉冲信号的脉冲强度阈值分析，滤掉未结合纳米颗粒的免疫磁珠产生的信号。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，对所述复合体的电脉冲信号，通过计算电迁移率得到复合体的粒子表面电位。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，对所述复合体的电脉冲信号，所述电迁移率通过如下公式计算：

其中，µ表示电迁移率，v(x)表示复合体粒子连续通过两个微孔的速度，E(x)表示电场分布；

粒子表面电位与电迁移率µ存在如下对应关系：

其中，表示电解液的粘度；

以及，粒子表面电位公式如下：

其中，t表示粒子在微孔中停留时间，A表示每个微孔的纠正系数，V表示电势差。