[发明专利]一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，属于代谢工程技术领域，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7‑还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。本发明提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。在本发明中，所述酿酒酵母工程菌中共表达甾醇Δ7‑还原酶和葡萄糖脱氢酶，就可以葡萄糖脱氢酶形成的NADPH作为辅因子，利用甾醇Δ7‑还原酶将酿酒酵母固有的麦角甾醇还原成菜籽甾醇，从而达到生物制备菜籽甾醇的目的。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种产生菜籽甾醇酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

菜籽甾醇(Brassicasterol,CAS号474-67-9)是一种重要的甾体化合物，它可以合成芸苔素内酯等农药，具有很重要的价值。菜籽甾醇主要通过植物提取获得，但由于菜籽甾醇在植物中的含量较低，分离纯化比较困难。化学合成菜籽甾醇已经获得成功，尚没有工业化生产的报道。菜籽甾醇来源稀缺导致了市售的菜籽甾醇价格非常昂贵。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种产生菜籽甾醇酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，本发明提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。

优选的，所述甾醇Δ7-还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述甾醇Δ7-还原酶基因编码的甾醇Δ7-还原酶的氨基酸序列如 SEQID No.2所示。

优选的，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述葡萄糖脱氢酶基因编码的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如 SEQ IDNo.4所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将甾醇Δ7-还原酶基因插入到pESC-Trp质粒中，得到pESCTrp-Δ7Red2 质粒；

2)将葡萄糖脱氢酶基因插入到步骤1)得到的pESCTrp-Δ7Red2质粒中，得到pESCTrp-Δ7Red2-GDH质粒；

3)将所述步骤2)得到的pESCTrp-Δ7Red2-GDH质粒导入酿酒酵母中，得到酿酒酵母工程菌。

优选的，扩增甾醇Δ7-还原酶基因使用的引物包括Fhis49398引物和 Rhis49398引物；

所述Fhis49398引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Rhis49398 引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，扩增甾醇Δ7-还原酶基因使用的程序为：94℃2min；94℃20s， 55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min。

优选的，扩增葡萄糖脱氢酶基因使用的引物包括FBamH12276引物和 RSal12276引物；

所述FBamH12276引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述 RSal12276引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的酿酒酵母工程菌在制备菜籽甾醇中的应用。