[发明专利]观察活细胞细胞膜表面及附近生物大分子的荧光成像方法

权利要求书

1.一种原位观察细胞膜及其附近生物大分子的方法，其中包括如下步骤：

步骤1、基于待观测的荧光供体选择符合FRET特征的淬灭剂作为荧光受体，其中选择所述淬灭剂使其无法自发扩散进入细胞膜内部；

步骤2、使用所述荧光供体标记待观测的生物大分子，记录其原始荧光寿命τ_D或原始荧光强度I_D；

步骤3、通过荧光共振能量转移原理模拟计算得到某一浓度的所述淬灭剂作用于所述荧光供体时R与I_DA/I_D的关系，或者R与τ_DA/τ_D的关系，其中R是所述淬灭剂与荧光供体的距离，I_DA是测定的受所述淬灭剂作用的荧光供体的荧光强度，τ_DA是测定的受所述淬灭剂作用的荧光供体的荧光寿命；

步骤4、用所述浓度的淬灭剂与标记有荧光标记生物大分子的细胞膜进行接触并记录所述荧光标记生物大分子的荧光信息，根据步骤3所确定的关系确定所述荧光标记生物大分子在所述细胞膜表面的径向距离；

其中，步骤1和步骤2顺序为任意的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述淬灭剂对被观察细胞不具有细胞毒性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1中，选择所述荧光供体，使得标记的待观测的生物大分子只具有单一荧光寿命峰值。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3包括：

步骤301，获得所述浓度值下淬灭剂荧光吸收谱F_D(λ)和供体荧光发射谱E_A(λ)；

步骤302，根据F_D(λ)和E_A(λ)计算单个所述荧光供体与所述荧光受体分子之间的荧光共振能量转移距离常数R₀，其中所述计算采用如下公式：

J(λ)＝∫₀^∞F_D(λ)E_A(λ)λ⁴dλ；

其中，Q_D为供体量子产率，n为介质的折射率，κ²是两个荧光分子之间的偶极取向因子，ε_A是受体最大的消光系数，J(λ)为归一化的供体发射光谱F_D与受体吸收光谱E_A的光谱重合系数，N_A为阿伏伽德罗常数；

步骤303，如果R₀处于0.1-20nm范围内，使用计算机模拟一定体积的所述浓度的淬灭剂分子，得到R与I_DA/I_D的关系，或者R与τ_DA/τ_D的关系，其中所述计算机模拟是以荧光共振能量转移原理的以下公式为基础而构建：

如果R₀在0.1-20nm范围之外，回到步骤1。

5.根据权利要求4所述的方法，其中观测在细胞膜外侧小叶上的生物大分子运动时，R₀需要处于1-5nm范围内；观测在细胞膜内侧小叶上的生物大分子运动时，R₀需要处于4-8nm范围内；观测在细胞膜内的生物大分子运动时，R₀需要处于7-20nm范围内。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4所述的记录生物大分子荧光信息是使用荧光共聚焦显微镜记录所述荧光标记生物大分子的荧光信息，其中所述显微镜的激光器为皮秒脉冲激光器，接收器为单光子探测器，计数器为时间相关单分子计数卡。