[发明专利]观察活细胞细胞膜表面及附近生物大分子的荧光成像方法

说明书

本发明提供一种观察活细胞细胞膜表面及附近生物大分子的荧光成像方法。其基于荧光共振能量转移原理,使用全内反射或者共聚焦照明的照明方式对所述大分子在细胞膜径向位移进行测量。所述方法包括特定荧光供体受体的配对规则，对活体细胞的荧光标记方案以及对测定数据的计算过程。本发明能够以较高时间和空间分辨率在亚纳米尺度观察细胞膜及细胞膜附近生物分子的运动状态与构象变化，同时不破坏细胞膜，能够保持对活体细胞的观测，其次本发明能够高通量快速地完成膜受体相关药物的筛选。

技术领域

本发明涉及用荧光成像方法观察生物大分子的技术领域，具体地说，本发明涉及一种原位观察活细胞的细胞膜内及细胞膜表面的大分子构象及位置变化的荧光成像方法。

背景技术

细胞膜是将细胞与外界环境分割开的选择透过性屏障，它控制着信息的流动和物质的进出，膜蛋白是很多药物的靶标。推进膜相关过程的研究依赖于能够测量膜中生物分子位置和构象变化的新技术。大多数膜相关过程发生在细胞膜内(插膜)或膜附近十纳米范围内。

现有技术通常使用荧光方法原位观察活细胞内生物分子构象变化与运动，步骤包括：1)将正常状态的细胞培养并接种到培养皿、多孔板或微流体孔道中；2)对细胞内的目标生物分子进行荧光标记(在细胞体外荧光标记之后将荧光分子导入体内或细胞内原位表达并标记荧光)；3)使用全内反射荧光显微镜，赝全内反射荧光显微镜，共聚焦显微技术，落射荧光显微镜、结构光照明显微镜或受激发射损耗荧光显微技术等荧光观察方法观察细胞内荧光标记分子。由于光的衍射效应的存在，可见光范围内的荧光显微镜 x、y方向分辨率只能达到约250纳米，z方向分辨率约为900纳米。即使使用更精确的结构光照明或STED显微技术观察细胞，也只能将荧光显微镜的分辨率提高到几十纳米。然而，细胞膜的厚度仅为4.5纳米左右，原位观察活细胞膜及其周围纳米范围的分子运动十分困难。

现有技术中已知的荧光共振能量转移(FRET)是一种高精度的光谱尺，是解决光学显微镜衍射极限的方法之一，可以用来探测亚纳米级别的供体的运动，荧光共振能量转移指的是当两个荧光基团离得足够近时，只激发其中一个荧光基团A，另一个荧光基团B会接收到非辐射能量，从A的荧光强度可以判断A、B两个荧光基团的间距，其空间分辨率可以达到纳米量级。但荧光共振能量转移方法要求受体的位置完全已知，只能用来简单的观察两个分子之间点对点的距离，这在流动的活细胞膜上很难实现，在膜体系中，由于膜存在流动性，膜上的分子沿着膜表面的切向会不断扩散运动，而真正与膜功能相关的分子运动是沿着膜的法向(即径向)的，在这种情况下常规的FRET方法无法有效得出该分子距离膜表面法向距离的变化。

现有技术中的电子显微镜具有较高分辨率，但是其通常只能在低温或真空环境观察固定的细胞样品，所以无法对活体细胞直接进行观测。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种原位观察活细胞膜及其附近生物大分子构象及位置变化的方法，来有利地克服现有技术的上述缺点和不足。

本发明是基于荧光共振能量转移原理FRET，其中，供体与受体间的能量转移效率E定义为:

J(λ)＝∫₀^∞F_D(λ)E_A(λ)λ⁴dλ (3)

τ_D＝1/k_D (4)