[发明专利]制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途

说明书

本发明公开了一种制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途。本发明的方法包括下述步骤：形成包括编码融合标签msyB的多核苷酸和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的表达载体；将所述表达载体转化至宿主菌中，得到转化的宿主菌；培养所述转化的宿主菌，使其表达包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基；将所述包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基分离和纯化；和将纯化后的包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基进行酶切，得到所述青鳉鱼肠激酶活性亚基。本发明的肠激酶活性亚基具有提高的特异性。

技术领域

本发明涉及制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途。具体而言，本发明涉及在宿主菌中制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途。

背景技术

肠激酶(Enteropeptidase，EK，EC3.4.4.8)是一类广泛使用的工具酶。天然肠激酶是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。在体内激活胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联^[1-2]。肠激酶分子量为150KDa，并且由1条115KDa的重链和1条35KDa的轻链组成。重链和轻链通过1个分子间二硫键结合。轻链是活性亚基，特异性识别DDDDK序列。因此，工业上常用的肠激酶为基因工程方法表达的肠激酶轻链活性亚基。同时，肠激酶是一类非常倾向于聚集的蛋白。肠激酶难以表达，容易在细胞内形成包涵体形式。但是，包涵体复性存在问题，其效率仅为2％^[3]。另外，虽然肠激酶特异性识别DDDDK序列，但是大量的研究表明，实际酶切反应中很易产生非特异性酶切。例如，在酶切大肠杆菌硫氧还蛋白-重组人生长激素融合蛋白(Trx-rhGH)时，因非特异性酶切而产生生长激素Nick蛋白，其对后续分离、目的蛋白产率甚至产品稳定性都带来较大影响。

因此，本领域亟需能够在宿主菌中可溶性表达，并且具有提高的特异性的肠激酶。

发明内容

为了解决上述问题，满足能够在宿主菌中可溶性表达，并且具有提高的特异性的肠激酶的需求，本发明人成功开发了一种能够在宿主菌中可溶性表达并且具有高特异性的青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法。

在一个方面中，本发明提供了一种制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法，所述方法包括下述步骤：

形成包括编码融合标签msyB的多核苷酸和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的表达载体；

将所述表达载体转化至宿主菌中，得到转化的宿主菌；

培养所述转化的宿主菌，使其表达包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基；

将所述包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基分离和纯化；和

将纯化后的包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基进行酶切，得到所述青鳉鱼肠激酶活性亚基。

通过上述方法解决了青鳉鱼肠激酶活性亚基可溶性表达和特异性的问题。

其中所述表达载体进一步包括纯化标签，优选地，所述纯化标签为6His。

6His标签利于融合蛋白的纯化。

其中所述6His在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间。

本发明人意外地发现，6His在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间时，所得青鳉鱼肠激酶活性亚基具有高的酶切特异性。

其中所述编码融合标签msyB的多核苷酸的序列如SEQ ID No:1中所示，并且所述融合标签msyB的氨基酸的序列如SEQ ID No:4中所示；

其中所述编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的序列如SEQ ID No:2中所示，并且所述青鳉鱼肠激酶活性亚基的氨基酸的序列如SEQ ID No:5中所示。