[发明专利]一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因和绿头鸭CD154基因；所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述绿头鸭CD154基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的N端添加有自裂解肽。

3.根据权利要求2所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述自裂解肽为T2A自裂解肽。

4.根据权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述绿头鸭CD154基因为进行密码子优化后的核苷酸序列，并在其N端加入有氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的柔性肽。

5.权利要求1～4任一项所述的重组鸭瘟病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取鸭瘟病毒TK基因编码区上游和下游序列作为同源臂，分别将其克隆至pEGFP-C1载体中，构建得到载体pDEV-Dtk；

(2)对鸭坦布苏病毒E蛋白基因进行密码子优化，并在其N端添加T2A自裂解肽，然后将其克隆至pDEV-Dtk载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVE；

(3)对绿头鸭CD154基因进行密码子优化，并在其N端加入柔性肽，然后将其克隆至pDEV-TK-DTVE载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVEF154；

(4)将pDEV-TK-DTVEF154质粒、基因编辑载体和鸭瘟病毒DNA共转染细胞，筛选纯化后获得所述重组鸭瘟病毒。

6.根据权利要求5所述的重组鸭瘟病毒的构建方法，其特征在于，所述基因编辑载体为pLentiCRISPR-TK1质粒和pLentiCRISPR-TK2质粒；其构建方法为：

以鸭瘟病毒基因组序列中TK编码序列为靶序列，将SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列分别克隆至pLentiCRISPR v2载体中，即可构建得到pLentiCRISPR-TK1质粒和pLentiCRISPR-TK2质粒。

7.权利要求1～4任一项所述的重组鸭瘟病毒在制备疫苗中的应用。