[发明专利]一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用。该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因和绿头鸭CD154基因；鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；绿头鸭CD154基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过在鸭瘟病毒基因中插入修饰后的鸭坦布苏病毒E蛋白基因和修饰后的绿头鸭CD154基因构建得到重组鸭瘟病毒，其具有免疫原性，可用于制备动物疫苗。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用。

背景技术

鸭瘟病毒(DEV)是一种α疱疹病毒，能引起鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽产生一种急性、热性、败血性、接触性传染病。鸭坦布苏病毒病是自2010年以来在我国蛋鸭和种鸭主产区爆发的一种以传播迅速、产蛋量骤降为主要特点的新传染病。

2010年4月以来，我国鸭主产区的蛋鸭和种鸭爆发一种新的传染病，该病以传播迅速、产蛋量骤降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征。通过病原分离鉴定和全序列测定，明确该病原属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、蚊媒病毒类(Mosquito-borne)、Ntaya病毒群，与该群Tembusu 病毒(TMUV)具有最近的遗传进化关系，可以认为是TMUV的一个新成员，暂定名为鸭坦布苏病毒。该病可危害不同品种的种鸭和蛋鸭，发病率高低不一，群内发病率高达100％，死淘率5％～15％，继发感染时死淘率可达30％。临床上主要表现为发病后2～5d内，鸭群的产蛋量骤然下降，从产蛋高峰迅速下降至30％～10％，严重的甚至停产。研究发现，该病毒主要危害除番鸭外的所有品种产蛋鸭、肉种鸭及野鸭等，最近也有产蛋鸡、鹅自然感染发病的报道。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失，而目前尚没有有效的疫苗及药物控制该病的发生。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用，通过在鸭瘟病毒基因中插入修饰后的鸭坦布苏病毒E蛋白基因和修饰后的绿头鸭CD154基因构建得到该组鸭瘟病毒，其具备免疫原性，可用于制备动物疫苗。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种重组鸭瘟病毒，重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因和绿头鸭CD154基因；鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；绿头鸭CD154基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，鸭坦布苏病毒E蛋白基因的N端添加有自裂解肽。

进一步地，自裂解肽为T2A自裂解肽。

进一步地，绿头鸭CD154基因为进行密码子优化后的核苷酸序列，并在其 N端加入柔性肽。

进一步地，柔性肽的氨基酸序列为：GSAGSAGGG(SEQ ID NO.7)。

上述重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)选取鸭瘟病毒TK基因编码区上游和下游序列作为同源臂，分别将其克隆至pEGFP-C1载体中，构建得到载体pDEV-Dtk；

(2)对鸭坦布苏病毒E蛋白基因进行密码子优化，并在其N端添加T2A 自裂解肽，然后将其克隆至pDEV-Dtk载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVE；

(3)对绿头鸭CD154基因进行密码子优化，并在其N端加入柔性肽，然后将其克隆至pDEV-TK-DTVE载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVEF154；

(4)将pDEV-TK-DTVEF154质粒、基因编辑载体和鸭瘟病毒DNA共转染细胞，筛选纯化后获得所述重组鸭瘟病毒。

进一步地，上游和下游的同源臂分别克隆至pEGFP-C1载体的AseI和MluI 酶切位点处。