[发明专利]一种全血的免疫发光分析用稀释液及其分析方法

权利要求书

1.一种采用全血的免疫发光分析用稀释液进行全血的免疫发光分析方法，其特征在于，步骤如下：

（1）偶联有PCT抗体的磁微粒混悬液的制备

（11）取羧基磁微粒于硅化离心管中，加入200~500μL pH值为5.0~6.5、浓度为0.05~0.2mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min使所述羧基磁微粒与所述MES缓冲液分离，弃去上清，重复上述步骤3次后加入200~500μL pH值为5.0~6.5、浓度为0.05~0.2mol/L的MES缓冲液重悬羧基磁微粒；

（12）再加入20~200μL4℃的浓度为10~200mg/mL的EDC偶联试剂，于旋转反应器上涡旋，室温孵育15~40min；

（13）孵育后去除上清液，用0.1M MES缓冲液清洗1次；

（14）清洗后加入150 μL MES缓冲液重悬羧基磁微粒，加入10~100μg降钙素原PCT抗体，混匀，室温反应2~4h；

（15）之后加入0.1~5mL封闭缓冲液进行封闭，时间为1~5 h；

（16）封闭后去上清，加入600 μL清洗缓冲液洗涤3次，得到偶联有PCT抗体的磁微粒混悬液，置于1.5 mL浓度为2mg/mL的保存液中，2~8℃保存备用；

所述保存液为10mMPBS、1%BSA、0.5%Tween-20、0.05%PC-300的混合液；

（2）吖啶酯标记的PCT单克隆抗体的制备

（21）在离心管中加入120 μL浓度为0.05~0.5M、pH值为8.0~10.0的 Na₂CO₃-NaHCO₃标记缓冲液，再加入0.2 mg的PCT单克隆抗体，混匀；

（22）之后加入5μL6.5 mmol/L的NSP-SA-NHS DMF溶液，避光反应至吖啶酯与PCT单克隆抗体的摩尔比为5~25:1，震荡混匀，室温下反应1~4h；

（23）再加入10~100μL质量浓度为10 %的赖氨酸，反应10~40min；

（24）将标记物NSP-SA-NHS-Ab与游离NSP-SA-NHS通过Sephadex G-25柱分离，用0.1mol/L pH值为6.3的PBS纯化缓冲液平衡并淋洗层析柱进行层析，过程中用紫外分光光度计检测产物200~800nm的光谱，分离得到吖啶酯标记的PCT单克隆抗体，之后加入质量分数1%的BSA和质量分数0.05%的防腐剂，分装冰冻保存备用；

（3）PCT校准品的制备

用含有20%全血的校准品缓冲液将降钙素原PCT纯品稀释成浓度为0、0.02、0.2、2、20、100ng/mL的校准品，所述校准品缓冲液为含1% BSA的10mM PBS，pH为7.4；

（4）检测

取全血的免疫发光分析用稀释液40 μL、校准品100μL、偶联有PCT抗体的磁微粒混悬液50 μL依次加入反应管中，振荡混匀，37℃孵育10~30min，分离，清洗，将洗涤后的反应容器继续加入10μL吖啶酯标记的PCT单克隆抗体继续孵育12min，分离，清洗，在全自动发光仪中进行测试，对测试结果与血清进行换算，全血与血清测试结果的换算公式如下：

y_血清＝1.14y_全血-0.43。

2.如权利要求1所述的一种采用全血的免疫发光分析用稀释液进行全血的免疫发光分析方法，其特征在于，所述封闭缓冲液为：浓度为50mM含1%（W/W）BSA的Tris缓冲液，pH值为7.2。

3.如权利要求1所述的一种采用全血的免疫发光分析用稀释液进行全血的免疫发光分析方法，其特征在于，步骤（16）中所述清洗缓冲液为pH7.0、浓度为5mmol/l的PBS缓冲液。