[发明专利]一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法在审
申请号: | 201911329061.1 | 申请日: | 2019-12-20 |
公开(公告)号: | CN111157634A | 公开(公告)日: | 2020-05-15 |
发明(设计)人: | 李江峰;史晓奕;刘佳鑫 | 申请(专利权)人: | 郑州大学 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02;G01N30/06 |
代理公司: | 重庆百润洪知识产权代理有限公司 50219 | 代理人: | 姚琼斯 |
地址: | 450001 *** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 种质 技术 检测 蛋白质 构象 变化 方法 | ||
1.一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤1:选取样品:选取肌红蛋白(Myoglobin,Mb)和脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin,ApoMb)为蛋白质样品,肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白的质量均为150μg;
步骤2:制备溶液:将肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白溶于1.5mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液中,得到蛋白质溶液;
步骤3:反应:蛋白质溶液中加入甲醛(CH2O)和氰基硼氢化钠(NaBH3CN),甲醛(CH2O)的要求为4.8μL,4%,氰基硼氢化钠(NaBH3CN)的值为4.8μL,0.6mol/L,氰基硼氢化钠(NaBH3CN)的终浓度为2mmol/L;
步骤4:加入碳酸氢铵:溶液中加入75μL,1mol/L的碳酸氢铵(NH4HCO3)进行反应,碳酸氢铵(NH4HCO3)的终浓度为50mmol/L;
步骤5:煮沸:溶液以100℃的温度煮沸4min,使蛋白变性;
步骤6:制备肽段溶液:加热完成后加入糜蛋白酶(Chymotrypsin),得到肽段溶液;
步骤7:进行检测:对得到的酶解肽段溶液进行酸化处理,使用液相色谱仪和质谱仪对溶液进行液相色谱分离和质谱检测。
2.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤2中,溶液中蛋白质的浓度为0.1μg/μL,4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液为20mmol/L,PH值为7。
3.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤3中,反应温度为4-40℃,室温下反应时间为5-200min。
4.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤4中,室温下进行反应,反应时间20min。
5.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤4中,碳酸氢铵与甲醛的摩尔浓度比的范围为10-100。
6.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤6中,糜蛋白酶与蛋白质的质量比为1:25。
7.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤6中,在水浴中酶解7小时,水浴温度37℃。
8.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤7中,液相色谱仪型号为Thermo Accela,质谱仪型号为Thermo LTQ-OrbitrapVelos。
9.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤7中,先用液相色谱仪对肽段溶液进行液相色谱分离,再使用质谱仪进行质谱检测。
10.根据权利要求1所述的一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:所述在步骤7中,检测完成后检测结果打印多份,对其中一份进行封档保存。
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