[发明专利]一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法

说明书

本发明公开了一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法，包括以下步骤：选取样品：选取肌红蛋白(Myoglobin，Mb)和脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin，ApoMb)为蛋白质样品，肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白的质量均为150μg；制备溶液：将肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白溶于1.5mL的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液中，得到蛋白质溶液；本发明通过设置选取样品、制备溶液、反应、加入碳酸氢铵、煮沸、制备肽段溶液和进行检测的工艺流程，解决了目前多数试剂会中和赖氨酸侧链的正电荷，导致标记后蛋白质结构的改变以及活性丧失的问题，该质谱技术检测蛋白质构象变化的方法，具备能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化，在标记过程中蛋白质活性保持不变的优点。

技术领域

本发明涉及蛋白质检测技术领域，具体为一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法。

背景技术

质谱(又叫质谱法)是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术，质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展，在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。

质谱技术在提供蛋白质结构信息方面有着巨大优势，和其他技术如X射线晶体衍射和核磁共振相比，它不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制，在应用质谱技术考察蛋白质结构时，通常需要对蛋白质进行化学标记处理，但是目前多数共价标记方法为了确保较高标记效率需要使用高反应活性的酰胺化反应试剂，这些试剂会中和赖氨酸侧链的正电荷，影响蛋白质中的静电相互作用，从而导致标记后蛋白质结构的改变以及活性的丧失，为此提出一种能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化，在标记过程中蛋白质活性保持不变，能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下构象的方法来解决此问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法，具备能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化，在标记过程中蛋白质活性保持不变，能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下构象的优点，解决了目前多数共价标记方法为了确保较高标记效率需要使用高反应活性的酰胺化反应试剂，这些试剂会中和赖氨酸侧链的正电荷，影响蛋白质中的静电相互作用，从而导致标记后蛋白质结构的改变以及活性的丧失的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法，包括以下步骤：

步骤1：选取样品：选取肌红蛋白(Myoglobin，Mb)和脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin，ApoMb)为蛋白质样品，肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白的质量均为150μg；

步骤2：制备溶液：将肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白溶于1.5mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液中，得到蛋白质溶液；

步骤3：反应：蛋白质溶液中加入甲醛(CH2O)和氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，甲醛(CH2O)的要求为4.8μL，4％，氰基硼氢化钠(NaBH3CN)的值为4.8μL，0.6mol/L，氰基硼氢化钠(NaBH3CN)的终浓度为2mmol/L；

步骤4：加入碳酸氢铵：溶液中加入75μL，1mol/L的碳酸氢铵(NH4HCO3)进行反应，碳酸氢铵(NH4HCO3)的终浓度为50mmol/L；

步骤5：煮沸：溶液以100℃的温度煮沸4min，使蛋白变性；

步骤6：制备肽段溶液：加热完成后加入糜蛋白酶(Chymotrypsin)，得到肽段溶液；

步骤7：进行检测：对得到的酶解肽段溶液进行酸化处理，使用液相色谱仪和质谱仪对溶液进行液相色谱分离和质谱检测。

优选的，所述在步骤2中，溶液中蛋白质的浓度为0.1μg/μL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液为20mmol/L，PH值为7。