[发明专利]一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒

说明书

本申请提供了一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒。具体而言，提供了一种从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外囊泡，尤其是外泌体的方法，包括任选地通过物理方法分离总细胞外囊泡，并任选地通过结合剂去除红细胞和/或白细胞源细胞外囊泡，并用结合甲状腺转录因子1的结合剂正向捕获目标细胞外囊泡或外泌体的步骤。本申请还提供了结合甲状腺转录因子1的结合剂用于制备细胞外囊泡或外泌体分离或检测试剂的用途，以及一种从生物体液中分离甲状腺转录因子阳性的细胞外囊泡或外泌体的试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本申请涉及分离组织特异来源的细胞外囊泡，例如外泌体的方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)也称胞外囊泡，包括微囊泡、外泌体(exosome)等，外泌体是细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外的，大小约30-100nm的囊泡，微囊泡是大小约100-1000nm的囊泡。细胞外囊泡具有脂质双层膜结构，广泛存在于所有体液中，包括唾液、血液、尿液和母乳等。目前研究发现外泌体中富含核酸(microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、胆固醇等，能作为信号分子传递给靶细胞，从而介导细胞间的物质传递与信息交流，调节多种生理或病理反应，包括有血管生长、肿瘤细胞侵袭与转移、免疫应答等。由于miRNA在基因表达调控上有着重要作用，外泌体中的miRNA受到最多的关注。外泌体miRNA通过循环囊泡传递信息，被认为是细胞间信号交流的第三种途径。除了miRNA外，研究表明外泌体中的circRNA、lncRNA和蛋白质也参与细胞内的信号调控。有研究表明外泌体在肿瘤微环境中含量尤其丰富，与肿瘤的发生发展、免疫逃逸、微环境建立密切相关。外泌体可保护其中的核酸类物质，防止其迅速降解；外泌体的形成与亲源细胞的状态密切相关；针对外泌体内容物的检测比传统的生物标志物更具有特异性。外泌体的这些优势，使其在肿瘤等疾病体外诊断、治疗领域被广泛研究和应用。

外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，几乎所有类型的活细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。利用体液外泌体针对不同疾病进行研究过程中存在其他细胞来源外泌体干扰问题，如在血液中进行肺癌外泌体相关研究，则会存在其他健康组织、其他器官、白细胞及红细胞来源的外泌体干扰，这些非疾病来源的外泌体极大地阻碍了其应用及研究。

用于外泌体或其他细胞外囊泡分离富集的技术应该体现出从各种样品基质中高效率分离的优点。随着科学和技术的快速发展，已经开发了许多技术用于分离富集高纯度的细胞外囊泡尤其是高纯度的外泌体。这些技术利用了外泌体的特定性质，例如外泌体的密度，形状，大小和表面蛋白进行分离富集，如超速离心法、超滤法、PEG沉淀法、凝胶排阻法等方法实现外泌体的提取分离。这些方法为外泌体带来了一系列独特的优点，但仍有较大不足，如存在纯度低、回收率低、分散性差、破坏完整性、难以广泛普及等，而最主要是不能有效富集到组织或疾病来源的外泌体。

因此，如何获得高特异性、高纯度的组织或疾病来源的细胞外囊泡，尤其是外泌体，对于促进外泌体的研究和应用至关重要。

发明内容

本发明通过如下实施方案实现了本发明的目的。

项目1.一种从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外囊泡的方法，包括：

任选地步骤1)，根据细胞外囊泡的物理参数，对所述生物体液通过物理方法，例如尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、微流体分离等分离获得总细胞外囊泡；

任选地步骤2)使用红细胞和/或白细胞通用的结合剂，例如，结合选自GPA、CD45、CD16、CD19、CD3、CD50、CD69的一种或多种生物标记的一种或多种结合剂与所述总细胞外囊泡接触，除去被结合剂结合的红细胞和/或白细胞源的细胞外囊泡；