[发明专利]基于驼源Fc片段的免疫原的制备及应用

说明书

本发明涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及基于驼源Fc片段的免疫原的制备及应用，所述的免疫原由目的蛋白与驼源Fc片段融合而成，所述的驼源Fc片段如SEQ ID NO:17‑22中的任意一条所示，编码基因序列分别如SEQ ID NO:23‑28所示。本发明公开了将目的基因与驼源免疫球蛋白Fc片段编码序列融合构建，表达、纯化后作为免疫原用来免疫驼源动物的方法，通过本发明所公布的驼源免疫球蛋白Fc片段基因序列、表达载体及宿主细胞，目的基因片段可以高效表达，并应用于驼源动物免疫。驼源Fc融合蛋白既保证了抗原的表达量和稳定性，也保证了抗原的免疫原性，为单域抗体的开发提供了很大的便利。

技术领域

本发明涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及基于驼源Fc片段的免疫原的制备及应用。

背景技术

抗体(Antibody,Ab)即免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是血液和组织液中的一类糖蛋白，由B细胞接收抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，主要存在与血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，是介导体液免疫的重要效应分子。抗体除了因其作为重要效应分子介导特异性体液免疫应答外，抗体在疾病的防治特别是感染性疾病的防治方面扮演者重要角色，Behring创立血清疗法因此获得医学与生理学诺贝尔将。此后，以多克隆、单克隆及基因工程抗体技术人工制备的抗体逐步应用于临床。仅2011年抗药药物就以480亿美元的销售额领跑全球药品市场，占整个生物制药市场的34.4％。至2017年，美国FDA和欧盟EMA批准的治疗性抗体药物有76个，主要用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗。

抗体作为可以特异性识别某一个目的蛋白(抗原)的分子，是通过该蛋白作为免疫原，免疫动物后又通过免疫学、细胞生物学以及基因工程手段获得的。抗体分子的分子量一般为150kDa左右，两条相同的重链和两条相同的轻链构成了抗体分子的多级结构。抗体分子在体外通过木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶的水解作用下可以变成Fab片段和Fc片段，Fab片段具有抗原识别能力，Fc片段游离出来。在体内，完整的IgG分子上的Fc片段还可以介导抗体依赖的细胞毒作用，进而杀伤靶标细胞。

在后续的研究当中，研究者发现，将IgG的Fc片段亚克隆出来，与目的基因进行融合、表达，与未融合之前，可以提高目的基因的表达量、纯化后的溶解度以及蛋白储存时的稳定性，并且由于Fc片段上有半胱氨酸的存在，两个Fc片段可以生成二硫键，所以在体外重组表达Fc融合蛋白时，一般会获得融合蛋白的二聚体形式，通过突变或者不突变Fc片段相应位置的半胱氨酸或者改变其他位置氨基酸电荷的情况，可以改变体外重组Fc融合蛋白的单体或者二聚体形式，这为研究者对目的蛋白的研究提供了非常便利的工具。Fc融合蛋白的优点固然重要，但其也有缺点，即Fc融合蛋白在作为免疫原去免疫动物时，会给研究者带来不小的困扰。单体Fc片段的大小在25kDa，对于异体动物其免疫原性很强，所以在Fc融合蛋白作为免疫原免疫动物后，研究者进行抗体筛选和鉴定时会获得大量针对Fc蛋白的抗体，而针对目的蛋白的抗体却了了无几，难以获得。而这些免疫原选择Fc融合表达的原因往往是：1.单独表达目的蛋白很困难，产量低、储存不稳定，2.目的蛋白自身免疫原性太弱，单独免疫动物不足以引发其体液免疫反应。所以在抗体开发过程中，对于单独制备难度较大的免疫原，找到一个更好的生产方法是亟待解决的问题。

在抗体开发过程当中，抗原的免疫的宿主最常用的是小鼠，小鼠的使用成本更低，结合噬菌体展示技术，其抗体开发的周期也可以控制到很短，对于小鼠免疫，由于动物重量很小，所以免疫原用量非常小，所以小鼠来源的抗体开发对于免疫原的制备总量要求不高，并且可以通过注射原核表达产物包涵体的形式实现。近十年来，驼源的单域抗体在抗体药物开发中愈发受到追捧，而驼源动物由于重量大，所需的免疫原量自然会更多，并且由于驼源动物的使用成本更高，且驼源动物体内更易产生针对构象表位的抗体，所以注射包涵体形式的免疫原给驼源动物就不是一个明智之选，所以免疫原的质和量对于驼源动物的免疫就成为非常重要的一个因素。所以，研究者又把目光投向了Fc融合蛋白。

发明内容