[发明专利]检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及其制法

说明书

本发明涉及一种新型的从血液样本中检测抗兰尼碱受体抗体（RyR）的电化学发光试剂盒及其制备方法。制备的试剂盒包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的RyR抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，RyR‑Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素生物反应信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中RyR‑Ab的准确定量检测。

技术领域

本发明涉及一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

自身免疫性疾病(以下简称“自免”)是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。正常情况下，免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当作外来物并对其进行攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。若不及时有效地加以控制，其后果十分严重：免疫系统的攻击会影响人体器官，且通常会终身对其进行攻击；有时还可能同时对身体众多部位造成损伤。早期筛查、诊断对管理和治疗自免来说非常重要，在早期阶段发现可避免或延迟目标器官或组织发生无法补救的损伤。

重症肌无力(MG)是由自身抗体引起的、细胞免疫依赖的、补体参与的主要累及神经肌肉接头突触后膜，引起神经肌肉接头传递障碍，出现骨骼肌收缩无力的获得性自身免疫性疾病。MG人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万MG患者[1]。MG在各个年龄阶段均可发病。在40岁之前，女性发病率高于男性；40～50岁男女发病率相当；50岁之后，男性发病率略高于女性。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。

MG是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体 (AChR)，乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)与NMJ上的乙酰胆碱受体(AChR)相结合，导致AChR数量减少和功能的丧失，AchR-Ab阳性是MG的主要免疫学致病机制，AchR-Ab在MG 中的阳性率为80％以上。但AchR-Ab并非存在于所有的MG患者中，且其与病情严重程度、是否合并胸腺瘤和发病年龄无相关性。近年研究发现，部分MG患者血清中存在针对骨骼肌和心肌横纹肌组分的抗体，包括肌球蛋白、肌动蛋白、细丝蛋白等，这些抗体称为横纹肌抗体。在约95％重症肌无力伴胸腺瘤(MGT)及50％晚发型MG患者血清中存在2种横纹肌抗体，即肌联蛋白(titin)和兰尼碱受体(RyR)抗体[2]。其中Titin-Ab对诊断MGT的敏感性高，而RyR-Ab 对诊断MGT的特异性高[3]。

兰尼碱受体(RyR)是肌浆网中的钙离子释放通道，连接肌纤维膜的T管和肌质网。T管的压力感受器二氢吡啶受体传递神经冲动至RyR，导致通道开放。肌浆网中的钙离子顺浓度差释放到胞质中，胞质中的钙离子与肌钙蛋白(troponin C,TnC)结合触发肌肉收缩。RyR受体有2种亚型：心肌RyR 2受体和骨骼肌RyR 1受体，MG患者血清中的RyR抗体可与这2种受体产生交叉反应。RyR-Ab可能通过干扰RyR和二氢吡啶受体的作用，从而抑制RyR通道的开放和钙离子的释放，使骨骼肌不能有效的收缩，导致肌无力的发生[4]。RyR-Ab在MG患者中的阳性率为13％～38％，在MGT中的阳性率为70％～80％，并且与MG患者的病情严重程度相关。 RyR-Ab对MGT的灵敏度为70％，特异度为95％[5]。目前RyR-Ab的检测方法主要包括ELISA 检测和免疫印迹法(Western blotting)检测[6]。这两种方法都存在重现性不高，结果不够准确，操作不便等缺陷。目前随着免疫检测技术的发展，磁珠法化学发光技术的优势愈发明显，特别是磁珠法电化学发光技术的准确性，灵敏度，重现性等性能明显好于ELISA等方法。目前尚无电化学发光技术用于RyR-Ab的检测。