[发明专利]构建侧翼已知序列的测序文库的引物组和方法

说明书

本发明提出了引物组，所述引物组包括：第一组引物和第二组引物，所述第一组引物包括第一引物和第二引物，沿5’端到3’端方向，所述第一引物包括第一特异性序列、第一间隔固定序列以及第一随机序列，所述第二引物包括第二特异性序列、第二间隔固定序列以及第二随机序列；所述第二组引物包括第三引物和第四引物，所述第三引物的3’端为所述第一间隔固定序列，所述第四引物的3’端为所述第二间隔固定序列。利用本发明的引物组可以获得具有不同长度的测序文库，尤其适用于侧翼已知序列，获得的文库可直接用于二代测序，操作简便快速，成本低廉，适于规模化应用。

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及构建侧翼已知序列的测序文库的引物和方法。

背景技术

已知侧翼序列获取未知序列的方法通常采用PCR扩增，通过侧翼序列扩增未知序列然后进行测序。如采用16S进行物种鉴定或进行菌种鉴定，都是在基因两端的保守区域设计通用引物，扩增中间的未知可变区域，然后扩增子进行测序，从而对物种进行鉴别。但是，该方法受限于未知可变的长度，当长度大于1kb时，不能对产物进行有效的测序。对于这种情况，现在常用的方法是通过长片段扩增后进行鸟枪法打断进行高通量测序，构建二代测序文库的策略通常是将扩增的长片段打断、Tn5转座或者通过多重PCR获得长度合适的小片段。

将长片段打断后建库是常用的建库方法，实验流程包括目的片段的扩增、扩增产物的纯化、纯化产物的片段化、末端修复、3端加A和连接接头，整个建库流程比较繁琐且成本相对比较高。Tn5转座法，如Illumina公司的Nextera技术，是通过包埋有通用序列的Tn5转座复合物将扩增产物片段化并加上通用序列，在通过通用引物扩增加上测序接头，该方法成本也相对比较高。

因此，目前针对侧翼已知序列构建测序文库的方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括：第一组引物和第二组引物，所述第一组引物包括第一引物和第二引物，沿5’端到3’端方向，所述第一引物包括第一特异性序列、第一间隔固定序列以及第一随机序列，所述第二引物包括第二特异性序列、第二间隔固定序列以及第二随机序列，所述第一特异性序列与双链DNA中第1链上5’端已知序列匹配，所述第二特异性序列与所述双链DNA中第2链上5’端已知序列匹配，所述第一间隔固定序列与所述双链DNA中第1链不匹配，所述第二间隔固定序列与所述双链DNA中第2链不匹配；所述第二组引物包括第三引物和第四引物，所述第三引物的3’端为所述第一间隔固定序列，所述第四引物的3’端为所述第二间隔固定序列。

根据本发明实施例的引物组包括两组引物组，第一组引物组中的两种引物均包含三段序列，包括特异性序列、间隔固定序列和随机序列。具体地，第一特异性序列和第二特异性序列能够分别锚定到侧翼已知序列5’端的已知序列上，基于DNA链在三维空间上的可折叠性，第一随机序列与第二随机序列分别与侧翼已知序列种的未知序列的任意位置碱基互补配对并延伸，得到不均等片段大小的产物。然后，采用第二组引物，其中包含两种引物，每种引物的3’端为间隔固定序列，由此，可以通过扩增产物中的间隔固定序列的反向链进行锚定互补，从而得到高通量测序文库。由此，利用根据本发明实施例的引物组可以获得具有不同长度的测序文库，尤其适用于侧翼已知序列，获得的文库可直接用于二代测序，操作简便快速，成本低廉，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，上述引物组还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述第一间隔固定序列和第二间隔固定序列为接头序列。该接头序列为测序平台所固有的接头序列，由此，以便在扩增过程中连接上测序接头，便于实现后续测序。

根据本发明的实施例，所述第三引物和第四引物的5’端包括文库标签序列和文库标签测序引物结合序列。由此，以便于后续识别和测序。